快速掌握三代测序有哪些我们不能忽视的质控点

测序技术经过第一代、第二代的发展，读长从一代测序的近 1000bp，降到了二代测序的几百 bp，通量和速度大幅提升，而第三代测序的发展思路在于保持二代测序的速度和通量优势的同时，弥补其读长较短的劣势。三代测序与前两代相比，最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行 PCR 扩增。

那么三代测序当中会有哪些质控点呢? 下面我们以 PacBio 为例为大家作以简单叙述：

与二代测序一样，PacBio 三代测序的第一步也是核酸提取，其次是建库，其最主要的区别是建库过程中不涉及 PCR 反应。DNA 分子打断之后，经过修复、接头连接、纯化和聚合酶绑定，即可出库准备上机测序。

质控点一：基因组 DNA 或 Total RNA

目前市场上的核酸提取大部分都是靠仪器去完成的，当然样本量少的情况下我们也会手动提取，因样本或提取试剂盒差异或多或少都会出现提取失败的情况，有时候也会因保存不当发生样本降解的情况，这时候就需要对提取后核酸进行质控了。

传统的质控方法是先对样本进行定量，浓度合格后再进行琼脂糖凝胶电泳检测，很是费时费力。全新的毛细管电泳技术是一种以毛细管为分离通道、高压直流电场为驱动力的新型核酸分离技术，相较于传统的琼脂糖凝胶电泳而言，具有高效、快速、成本低、应用模式开放等显著优势，目前已在分子生物学领域迅速推广开来。小编今天为大家介绍的就是这样一款 Qsep 全自动毛细管电泳仪（图 1），无需配胶加染料，无需进行凝胶成像，轻轻松松就可获得想要的结果。

以下图例为 Qsep 全自动毛细管电泳仪检测的实验结果图。对基因组 DNA（图 2）来说，它可以直观的看到片段大小及降解程度，并提供 DQN 值（1-10 分）对基因组 DNA 进行完整性评估；对 Total RNA（图 3）来说，除了直观呈现 18s 和 28s 峰型分布和占比之外，同样也会有标准化评估的 RQN 值（1-10 分），分值越高代表完整性越好。
                                     

质控点二：打断后的 DNA 片段及片段筛选后的文库

例 1：在基因组测序文库构建过程中，要先将基因组 DNA 打断破碎成大片段（通常是 20kb 左右），之后经过末端修复、接头连接、片段筛选、杂交测序引物和 DNA 聚合酶绑定（图 4）等步骤，我们的 SMRT Bell DNA 文库就制备成功了。那打断后的 DNA 及片段筛选后的文库（图 5）是否是我们想要的大小呢，会不会有小片段残留，都可以通过 Qsep 全自动毛细管电泳仪来进行质控，它目前可以测到的最大片段为 165k（图 6）。整个文库构建过程没有经过 PCR，这也是三代基因组测序文库构建的最大亮点！




例 2：同样，在全长转录组测序文库构建中，也可以用 Qsep 全自动毛细管电泳仪来进行质控，它的文库制备要相对较为复杂那么一点。首先，我们需要从总 RNA 中筛选获得 polyA(+)RNA，之后利用 SMARTer™PCR cDNA Synthesis Kit 进行反转录合成 cDNA。cDNA 合成后需要使用 KAPA HiFi PCR Kit 进行 PCR 扩增，扩增后按片段大小对 cDNA 进行分选，为保证获得足够量的 cDNA 进行后续建库测序，分选后 cDNA 片段经过 PCR 再次扩增，之后经过末端修复、接头连接、片段筛选、杂交测序引物和 DNA 聚合酶绑定就可以上机测序了（图 7）。



质控点三：数据质量

与二代测序的碱基质量标准 Q20/Q30 不同，三代测序由于其随机分布的碱基错误率，其单碱基的准确性不能直接用于衡量数据质量。那么，怎么判断三代测序的数据好不好呢？

在上游实验环节，最关键的影响因素是文库的构建。高质量的文库产出的数据长度长，质量好；而低质量的文库产出的数据长度短，质量差。其次，就是看比例，需要关注有两个比例：一个是 subreads 与 polymerase reads 数据量的比例，比例过低反映测序过程中的低质量的序列较多；一个是 zmw 孔载入比例，根据孔中载入的 DNA 片段数分为 P0、P1 和 P2，P1 合理比例在 40%-60% 之间，上样浓度异常会导致 P0 或 P2 比例过高，有效数据量减少。不管是二代还是三代测序，想要下机数据好，前期的步步质控是关键。