同样是做测序，为什么别人 FFPE 样本测序这么顺利？

使用福尔马林固定石蜡包埋处理的样本（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE）可以保存原有正常的结构和功能，并且能在常温保留很久。大部分样本主要与肿瘤相关，随着精准医疗对病理科的影响渗透，以及研究手段的不断升级，研究人员对积攒了百年之久的FFPE样本在分子层面的研究也越来越多，研究这些组织样本为探讨新的肿瘤分类、诊断和预后标准，开发肿瘤早期检测的实验技术、转化医学和个体化医学提供了有利的依据，但是 FFPE 样本特殊的制作方法和保存过程都对样本中的核酸造成多方面的影响，尤其是 DNA 和 RNA 的降解问题。

二代测序技术的飞速发展，大大地提高了样本测序速度，降低了测序成本，也使得应用二代测序方法对 FFPE 样本中的的 DNA 和 RNA 进行测序成为可能。然而由于从 FFPE 样本中提取出的核酸样本比较特殊（有可能降解严重，完整性较差），因此对 FFPE 样本的质控成为文库构建以及能否测序成功的关键。
 

图 1：不同平台二代测序流程

一、 FFPE 提取样本质控
FFPE 样本中提取的 gDNA 一般会从浓度、纯度和片段完整性三个方面进行质控。浓度和纯度可以通过 EzDrop 1000 超微量分光光度计这类仪器进行质控，它可提供核酸样本的 A230、A260 和 A280 数据，然后通过 A260/230 和 A260/280 的比值来判定样本的纯度。对于 DNA 样本，A260/A280 为 1.8-2.0，说明样本纯度是合格的；A260/A280<1.6,说明有蛋白质或酚等污染；A260/A280>2，说明 RNA 没有除干净或 DNA 已变性。对于 RNA 样本， A260/A280为1.8-2.0，说明样本纯度是合格的；A260/280＞2.0 则说明RNA 可能已经存在降解；A260/280＜1.8 则说明有蛋白质或其他杂质残留。  
                

                 图 2：Qsep 系列全自动核酸蛋白分析系统（生物片段分析仪）

FFPE  样本的完整性质控方面，则可以通过 Qsep 系列全自动核酸蛋白分析系统（生物片段分析仪）完成。

DNA 质量评分：DQN

通过计算基因组质量评分 DQN（DNA Quality Number），可以高效地评估 gDNA的质量。由 Qsep 开发用于片段分析仪，数据分析软件评估每个样品与用户定义的特定应用阈值用于「高质量的 DNA」，并指定 0 到 10 之间的 DQN 值。数值反映高于定义的阈值的 DNA 的百分比。

对于 FFPE 提取的 gDNA 样本，Qsep 系列全自动核酸蛋白分析系统软件具有基因组 DNA 质量评分值（DQN）系统，可以高效评估 FFPE 基因组样本质量。可为样本库中评价核酸的质量标准提供数字化的标准。

图3：不同质量 gDNA 样本 DQN 值比较（FFPE 提取）

RNA 质量评分：RQN

Qsep 全自动核酸蛋白分析系统有两个指标可用于评估 RNA 的质量。首先是软件计算RNA质量评分数值 RQN（RNA Quality Number），RQN值范围为 1 到 10， 是基于专有的计算算法，考虑 RNA 电泳图谱的整个分布.
 

图 4. 不同质量 RNA 样本 RQN 值比较
 

图 5 total RNA 样本梯度稀释结果

尽管 RQN 值是从新鲜组织分离的 RNA 的质量的可靠质控标准，但它们并不是福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）样品的 RNA 质量的准确质控评价手段。 为了解决这个问题，Illumina 的科学家开发了 DV200 这个检测标准，它可以计算RNA片段大于 200nt 大小的百分比。 考虑到 DV200 值和二代文库产量之间的更强的相关性，与 RQN 值相比，DV200 评分体系对于评估 FFPE RNA 质量是更为贴切的。Qsep 系列全自动核酸蛋白分析系统可以直接提供不同样本的 DV200 的数值。

图 6：不同质量 Total RNA 样本 DV200 值比较（FFPE 提取）

二、 文库构建过程的质量控制
结合 Qsep 提供的 DQN 值可进行是否可进行建库判断，根据不同大小的 DQN数值也可设置不同的打断条件，以期获得稳定的符合预期的片段大小，将片段化后的样本按照标准流程进行文库构建，利用 Qsep 仪器可以分析文库片段大小的分布范围是否符合建库的要求（见图 7）：左侧是一个正常的打断文库，右侧文库在打断中，没有打断彻底，导致文库整体片段偏大，不建议继续进行下一步验。

图 7.  不同文库比较

图 8 文库片段分布分析
 

在上机前文库质控中，可通过Smear分析确定文库的主要片段分布区域，以及其平均片段长度。

在整个二代测序过程中，无论是对核酸的质控还是对文库打断样本和上机前文库的质控，Qsep 系列全自动核酸蛋白分析系统作为一台核酸质控设备，可以为用户更简便，更准确地提供对应的数字化质控数据，为后续的高质量的测序数据提供保证。

近年来，国产企业奋力直追，积极布局，国产设备逐渐兴起，并在国内占据一定的市场份额。Qsep 致力于更加灵活的通量、更简单的操作、更短的时间与更低的成本，为中国的测序前处理质控环节提供了强有力的支持和自信心。