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多么痛的领悟 ——流式细胞术在风湿免疫疾病中的应用
提到痛，你会想起或正经历什么样的痛呢？
有些痛是心理上的一种感觉，比如看见学习（此处也可以是工作或其它事项）就头痛、想到哪次的失败和遗憾就心痛，这些痛会随着时间的流逝和内心的成长逐渐消散。
而有些痛就不一样了，是种生理上的疾病或疾病的表现，比如年纪轻轻就腰酸背痛——正翘着二郎腿或者葛优躺的你一定深有感触吧，但我想说的是关节炎；比如炎炎夏日沉迷于海鲜、啤酒和烧烤，终于两行热泪喜提痛风大礼包。关节炎、痛风等是风湿免疫科常见的疾病。
今天，让我们一起分享一份“痛”的领悟——流式细胞术在风湿免疫疾病中的应用
风湿免疫疾病简介
风湿免疫疾病（Rheumatic diseases）是指一组主要累及骨、关节和软组织的疾病，主要是自身免疫系统的异常造成关节炎等各个系统器官的损伤，这类疾病通常与机体免疫系统功能紊乱有关。激素和生物制剂通过阻断关键炎症性细胞因子或细胞表面分子在风湿免疫病的治疗中发挥重要作用, 如常见的肿瘤坏死因子 -α(TNF-α) 抑制剂（依那西普、英夫利西单抗、阿达木单抗）、白细胞介素 -6 受体( IL-6R)抑制剂、选择性T细胞共刺激调节剂以及其他生物制剂如 CD20 靶向药物（利妥昔单抗）等。
风湿免疫病分类 | 代表性疾病 |
弥漫性结缔组织病 | 系统性红斑狼疮 |
脊柱关节病 | 强直性脊柱炎 |
退行性关节病 | 骨关节炎 |
晶体性和代谢性关节病 | 痛风和假性痛风 |
感染性关节病 | 直接感染引起（如莱姆病）和细菌性关节炎。间接感染引起（如反应性关节炎），病毒性肝炎性关节炎等 |
神经相关疾病 | 腕管综合征、反射性交感神经营养不良等 |
肿瘤相关疾病 | 滑膜瘤和滑膜肉瘤，另外肺部原发肿瘤引起的骨、关节等症状 |
有关节和骨表现的疾病 | 弥漫性特发性骨肥厚、变形性骨炎、肋软骨炎、致密性髂骨炎和骨坏死等 |
无关节和骨表现的疾病 | 腱鞘炎、筋膜炎、血管舒缩障碍（如红斑性肌痛病和雷诺病或雷诺现象）等 |
其他 | 纤维肌痛综合征、结节红斑、结节性脂膜炎、家族性地中海热和肺出血肾炎综合征等 |
表 1. 风湿免疫疾病的分类
流式细胞术在临床免疫相关疾病的精准诊治中发挥重要作用，通过对免疫细胞及细胞因子等的检测来评估机体整体的免疫状态和功能，检测疾病发病和治疗相关的靶点从而为早期诊治、个性化治疗、指导用药剂量和疗程、病情和预后监测提供重要指标和参考依据。
图 1. 自身免疫性疾病的发展
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流式细胞
检测项目
TBNK 淋巴细胞亚群
项目介绍
淋巴细胞是构成人体免疫系统的主要细胞，流式细胞术可以基于不同淋巴细胞亚群表型和功能的标记物进行鉴别和分型，包括 CD3+T 淋巴细胞、 CD3+CD4+ 辅助/诱导T淋巴细胞、CD3+CD8+ 抑制/杀伤 T 淋巴细胞、CD3-CD19+B 淋巴细胞和 CD3- (CD16+CD56)+NK 淋巴细胞，简称为 TBNK。自身免疫疾病发病、进展以及治疗过程中常伴随着 TBNK 淋巴细胞数量、比例和功能上的变化。TBNK 淋巴细胞亚群检测能反映机体当前的免疫状态，辅助疾病诊断，同时对分析疾病的发病机制、B 细胞清除疗效评估、副作用及预后监测提供参考依据。
检测方案和优势
❖
体积法绝对计数——准确度高、检测成本低
❖
单管六色方案——结果客观准确、无管间误差、减少工作量和试剂耗材用量
检测指标与意义
免疫细胞亚群 | 结果 | 临床意义 |
CD3+T 细胞 | ↑ | 提示细胞免疫功能增强，常见于免疫亢进状态，如再生障碍性贫血，慢性活动性肝炎，传染性单核细胞增多症，自身免疫病，重症肌无力等。 |
↓ | 提示细胞免疫功能下降，如病毒感染，免疫缺陷病，应用免疫抑制剂，淋巴造血系统肿瘤，恶性肿瘤等。 | |
CD4+Th 细胞 | ↑ | 提示较强的细胞免疫反应，如器官移植排斥反应，自身免疫病，细菌感染等。 |
↓ | 提示机体免疫功能处于低下状态，如亚健康、感冒，恶性肿瘤，病毒感染，原发性免疫缺陷病，慢性活动性肝炎，自身免疫病、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎等，以及应用免疫抑制剂等 | |
CD8+Tc 细胞 | ↑ | 自身免疫性疾病（如 SLE 等），慢性活动性肝炎，结核，病毒感染（EBV，CMV、HBV 感染等），胞内菌、真菌感染，寄生虫，器官移植排斥反应，恶性肿瘤早期升高，中晚期降低。 |
↓ | 细菌感染，变应性鼻炎，干燥症等。 | |
Th/Tc 比值 | ↑ | 免疫功能处于“过度活跃”状态，见于 RA、SLE、多发性硬化、I 型糖尿病等自身免疫病，以及器官移植排斥反应等 |
↓ | 免疫功能处于“免疫抑制”状态，多见于艾滋病、AA、某些白血病、传染性单核细胞增多症、免疫缺陷综合征、某些病毒感染、恶性肿瘤、结核病等。 | |
CD4CD8 双阳 DPT | ↑ | 正常人外周血中 DPT 细胞极少，但是在重症肌无力、原发性免疫性血小板减少症、多发性硬化症等自身免疫病，以及血液肿瘤中数量异常增高. |
CD4CD8 双阴 DNT | ↑ | 外周血 DNT 升高主要见于包括感染性和非感染性疾病等在内的常见临床炎症性疾病，如：肺部细菌性感染、全身性病毒感染、胸膜炎、创伤、急性扁桃体炎等，另外在血液肿瘤、自身免疫病中也常见 DNT 升高。 |
B 细胞 | ↑ | 细菌感染（G+ 菌升高比 G- 菌明显），自身免疫病，变态反应，ITP 可增高，病毒感染早期也可升高，B 细胞淋巴造血系统肿瘤等 |
↓ | 原发性免疫缺陷病，部分 EBV 感染，体液免疫功能不良，淋巴造血系统肿瘤，应用 B 细胞的靶向药物（利妥昔单抗等），生命垂危时可呈现极度减少。 | |
NK 细胞 | ↑ | 病毒感染初期，肿瘤早期会升高，化学毒物或药物中毒，II 型超敏反应，习惯性流产，长期使用干扰素等。 |
↓ | 原发性免疫缺陷病，感染中、后期，肿瘤的中晚期降低，使用免疫抑制剂。 | |
NKT | ↑ | 在多种细菌、病毒、霉菌和寄生虫感染中发挥抗感染作用，另外可能与自身免疫性疾病的发病机制、变态反应的调节及抑制寄生虫感染等有关。 |
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流式细胞
检测项目
HLA - B27
项目介绍
HLA-B27 蛋白是一种主要组织相容性复合体 I 类蛋白，属 HLA-I 类分子,存在于所有有核细胞和血小板表面。HLA-B27 是 HLA-B 位点上的一个重要等位基因，它与许多疾病呈强相关，尤其是强直性脊柱炎 (Ankylosing Spondylitis, AS)，此外还有葡萄膜炎，银屑病关节炎，反应性关节炎，炎症性肠病性关节炎，幼年型脊柱关节炎及未分化脊柱关节炎。流式细胞仪使用荧光定量标准微球校正实验条件，利用 CD3 设门圈中 T 淋巴细胞，检测 T 淋巴细胞表面 HLA-B27 抗原表达和判断阴阳性。
检测方案和优势
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配套的检测试剂、仪器、软件
❖
方法简易、自动化分析和报告
❖
仪器质控与定量校准同时进行，减少工作量和试剂耗材
❖
有效避免 HLA-B7 抗原的干扰
项目 | FITC | PerCP |
HLA-B27 | HLA-B27 | CD3 |
检测指标与意义
在临床上，由于 AS 的症状与许多疾病相似而难以确诊，国际脊柱关节炎评估工作组（ASAS）早在 2009 年推荐的中轴型 SpA 分类标准中已将 HLA-B27 阳性列入其中，这对于早期诊断 AS 有一定的帮助。因此，准确检测 HLA-B27 有助于 AS 的辅助诊断。
参考资料：
流式细胞
检测项目
调节性 T 细胞
项目介绍
Treg 是 T 细胞的一个亚群，约占外周 CD4+T 细胞的 5%~10%。Treg 在妊娠维持、预防自身免疫反应以及抑制几乎所有免疫反应（包括对自身细胞、癌症、感染和移植的反应）方面发挥着关键作用。在一些自身免疫性疾病如多发性硬化症、活动性类风湿关节炎和 I 型糖尿病等，Treg 的数量下降及功能表现为降低；另一方面，在许多恶性肿瘤、脓毒症等表现为明显增高。Treg 细胞具有治疗潜力，可以通过消耗/抑制 Treg 细胞功能来促进抗肿瘤免疫，或重新增强 Treg 细胞的功能来减轻慢性/自身免疫炎症。
根据是否曾受到抗原的刺激, 可分为纯真、效应和记忆 Treg 细胞等。纯真细胞是指未经抗原刺激的成熟细胞，经过抗原刺激后纯真细胞增殖分化为效应细胞。纯真 Tregs 的抗炎强度有限，在淋巴结内诱导 TCR 后增殖并发育成高抑制性和免疫分化的效应 Treg (eTreg)，eTreg 可抑制免疫系统发挥作用；少数 eTreg 细胞分化为记忆 Treg 细胞（mTreg）长期存活，当再次受到抗原刺激时 mTreg 能够迅速增殖并发挥效应功能。
检测方案和优势
❖
体积法绝对计数——准确度高、检测成本低
❖
单管五色方案——结果准确客观、无管间误差、减少工作量和试剂耗材用量
❖
同时分析 Treg 及亚群——让精细分型更精细
检测指标与意义
免疫细胞亚群 | 结果 | 临床意义 |
调节性 T 细胞 | ↑ | 升高提示机体免疫功能处于抑制状态，如妊娠期、肿瘤患者、感染性疾病等 |
↓ | 下降常引起免疫系统反应过激，导致自身免疫性疾病、自身炎症性疾病、过敏等，如类风湿关节炎、川崎病、自身免疫性肝炎、系统性硬化症、重症肌无力、系统性红斑狼疮、Ⅰ 型糖尿病、甲状腺炎、溶血性贫血、移植排斥反应、习惯性流产、皮肌炎、多发性肌炎、银屑病、过敏性皮炎、食物过敏、高免疫球蛋白 E 血症、炎症性肠病等 | |
纯真 Treg | ↑ | 系统性红斑狼疮，意义未明的单克隆丙种球蛋白病，多发性骨髓瘤等 |
↓ | 提示胸腺 Treg 生成不足；随年龄增长而降低 | |
记忆 Treg | ↑ | mTregs 拥有促炎趋化因子受体，可以迁移到发炎组织并抑制发炎组织的免疫反应；在结节病、炎症、感染、结肠癌和肝癌患者中可见增加；随年龄增长而增加 |
↓ | 系统性红斑狼疮 |
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流式细胞
检测项目
B 细胞精细分型
项目介绍
B 细胞在体液和细胞介导的免疫反应中发挥着关键作用。B 细胞由不同的亚群组成，具体取决于其发育或增殖状态、位置和功能。 B 细胞来源于骨髓中的造血干细胞，在骨髓发育成熟的纯真 B 细胞离开骨髓迁入周围淋巴器官和淋巴组织，纯真 B 细胞受抗原刺激后分化为产生抗体的浆细胞和长寿记忆性 B 细胞，发挥重要免疫功能，包括分泌抗体介导体液免疫应答、递呈抗原、分泌细胞因子参与免疫调节、参与炎症反应等。
异常 B 细胞识别自身抗原，并分泌攻击自身组分的抗体，是人类多种自身免疫病的发病机制。与 B 细胞异常相关的自身免疫病包括硬皮病、多发性硬化症、视神经脊髓炎、肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、Ⅰ 型糖尿病和类风湿性关节炎等；与 B 细胞及其前体细胞和浆细胞异常相关的疾病包括多种血液疾病和淋巴瘤。
检测方案和优势
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体积法绝对计数——准确度高、检测成本低
❖
单管六色方案——结果准确客观、无管间误差、减少工作量和试剂耗材用量
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同时分析 B 细胞分化及亚群——免疫精细分型，助力精准诊疗
检测指标与意义
免疫细胞亚群 | 结果 | 临床意义 |
CD19+B 细胞 | ↑ | 升高见于自身免疫性疾病，提示机体体液免疫功能增强，常见于变态反应性疾病、各种细菌性感染、儿童特发性肾病综合征、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和伯基特淋巴瘤等 |
↓ | 见于传染性单核细胞增多症，见于原发性免疫缺陷病或继发性免疫功能低下，如无丙种球蛋白血症、重症联合免疫缺陷；使用化疗、B 细胞耗竭剂（如利妥昔单抗、贝利尤单抗等）或免疫抑制药后；临床可出现反复发作的呼吸道及消化感染，严重病毒感染，生命垂危时可呈现极度减少 | |
CD5+CD19+B1 细胞 | ↑ | B1 异常增高常见于慢性淋巴细胞白血病、原发性干燥综合征、免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、系统性红斑狼疮活动期等自身免疫相关疾病 |
CD5-CD19+B2 细胞 | ↑ | 升高见于自身免疫性疾病，提示机体体液免疫功能增强，常见于变态反应性疾病、各种细菌性感染、儿童特发性肾病综合征、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和伯基特淋巴瘤等 |
↓ | 降低见于原发性免疫缺陷病如无丙种球蛋白血症、重症联合免疫缺陷；使用化疗、B 细胞耗竭剂（如利妥昔单抗、贝利尤单抗等）或免疫抑制药后；生命垂危时可呈现极度减少 | |
CD20+B 细胞 | ↑ | 升高见于变态反应性疾病、细菌感染、儿童特发性肾病综合征、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和伯基特淋巴瘤等 |
↓ | CD20 是检测和治疗 B 细胞淋巴瘤的有效靶标，抗 CD20 单抗用药前后动态监测 CD20+B 细胞数量，用于评估药效单次输注 CD20 单抗后 3 天内，患者外周血 B 淋巴细胞可减少 90%，多数患者这种剂量依赖性 B 细胞减少状态将持续 2~3 个月，一般 6 个月后患者外周血 B 淋巴细胞恢复；若患者在使用 CD20 单抗治疗后，外周血 B 细胞计数未出现明显减少或无剂量依赖，提示患者对 CD20 单抗治疗低反应，则可考虑更换治疗方案肾小球肾炎患者外周血 CD20+ 或 CD19+ B 细胞 ≥5个 /mm3 时，追加 RTX 剂量，对患者维持治疗、减少复发时有效 | |
CD27- 纯真 B 细胞 | ↑ | 贝利尤单抗治疗有效时纯真 B 细胞增加；自身免疫性疾病如 SLE、RA 和 CVID 等增加 |
↓ | 反应机体免疫储备能力降低 | |
CD27+记忆 B 细胞 | ↑ | 记忆 B 细胞数量增加与感染、炎症反应、自身免疫病活动期相关，如在 HIV、SLE、RA、流感等中增加；肾病综合征患者治疗后记忆 B 细胞升高提示复发风险高；视神经脊髓炎谱系疾病患者若 CD19+/CD20+B 细胞比例 >1% 或 CD27+ 记忆 B 淋巴细胞比例 >0.05%，建议重复进行 RTX 注射治疗 |
CD19+CD20- CD27+CD38bri 浆母细胞 | ↑ | 在多种自身免疫病如肾病综合征、系统性红斑狼疮、ANCA 相关性血管炎等表现为升高；同时，外周血浆母细胞水平可作为利妥昔单抗、贝利尤单抗治疗后预测和评估药效、优化治疗方案和周期、预测复发的重要临床指标 |
CD19+CD38briSSC 大浆细胞 | ↑ | 在正常情况下，浆细胞不会出现于外周血；引起浆细胞增高常见的原因有病毒感染、变态反应性疾病、结缔组织病、结核病及其他慢性感染性疾病、慢性肝病、恶性肿瘤、再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症、骨髓增生异常综合征等造血系统疾病 |
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流式细胞
检测项目
nCD64 指数和 mHLA-DR 表达率
项目介绍
机体在病原体的刺激后启动一系列免疫应答反应，伴随单核细胞、中性粒细胞等免疫细胞的应答及细胞因子的释放等。单核细胞在炎症性疾病的发病机制中参与免疫防御、抗原提呈作用，单核细胞上的 HLA-DR 属于 MHC Ⅱ 类分子，能将抗原提呈给辅助性 T 细胞，诱导适应性免疫应答的启动。在炎症及感染状态下单核细胞 HLA-DR 的表达水平会下降。多项研究证实，危重患者中单核细胞 HLA-DR 的低表达与患者发生免疫抑制、脓毒血症密切相关。
CD64 是免疫球蛋白 G (IgG) 的 Fc 受体之一，参与 Ig 介导的生理功能或病理损伤过程。正常情况下中性粒细胞上 CD64 处于低水平表达，当外来病原体侵入时，微生物细胞壁成分、补体分裂产物和某些促炎细胞因子等刺激后 CD64 表达迅速上调，且 CD64 的表达量与感染程度、预后密切相关。
由于激素类药物和免疫抑制剂的广泛使用，自身免疫性疾病患者易并发感染。临床上将活动期自身免疫性疾病和并发感染性疾病区分对于患者准确、及时的治疗具有重要意义。CD64 指数因不受皮质激素、疾病活动度、抗风湿类药物及生物制剂影响，从而在区分感染性炎症和活动性自身免疫性疾病中具有高的敏感性和特异性。
通过流式细胞仪检测中性粒细胞 CD64、单核细胞表面 HLA-DR 的表达水平可作为一种诊断细菌感染、评价感染病情、免疫状态和指导抗生素使用的新型检测方法。
检测方案和优势
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单管四色方案——内参对照，分析结果更加准确
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同时分析感染和免疫抑制评估指标——小方案、大用途、感染免疫相结合
项目 | FITC | PE | PerCP | APC |
nCD64 指数和 mHLA-DR% | CD14 | CD64 | CD45 | HLA-DR |
检测指标与意义
检测指标 | 结果 | 临床意义 |
mHLA-DR% | ↓ | 提示机体整体免疫状态低下，常见于创伤、大手术后、脓毒症、肿瘤、老年人等 |
nCD64 指数 | ↑ | 提示细菌感染的可能性大，也见于部分病毒感染（如 EBV）和一些药物治疗后（如干扰素 γ、粒细胞集落刺激因子） |
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流式细胞
检测项目
细胞因子检测
项目介绍
细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子参与了众多自身免疫病的发生发展，不仅可以作为疾病重要的生物标志物，还能够用于不同自身免疫病的鉴别诊断，是疾病临床过程监测及预后的重要靶点。此外，针对细胞因子的抗体和小分子抑制剂被逐步应用于临床，也为自身免疫病提供治疗策略。利用流式荧光捕获微球检测待测样本中的 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 细胞因子含量，可以为临床提供诊断、治疗、监测的辅助信息。
检测指标与意义
在自身免疫病发生和发展的过程中，分泌 IL-2、lFN-γ 和 TNF-α 的 Th1 型细胞因子具有增强杀伤细胞的细胞毒性的作用，介导细胞免疫、细胞毒性 T 细胞和巨噬细胞活化以及迟发性超敏反应；而分泌 IL-4、IL-6 和 IL-10 的 Th2 型细胞因子则有抗炎效应，介导体液免疫、B 细胞和嗜酸性粒细胞活化以及 IgE 的生成。在自身免疫病中，Th1 可诱导发病，加速疾病进展；Th2 能阻止发病，缓解病情。因此风湿免疫病患者检测细胞因子可用于评估疾病病情和进展、治疗监测及预后评估、指导生物制剂个性化治疗和辅助感染的早期诊断和 G-/+ 的鉴别等。
免疫细胞亚群 | 细胞因子 | 结果 | 常见风湿免疫病 |
Th1 型细胞 | IL-2 | 具有双重免疫调节活性：高剂量 IL-2 具有抗肿瘤及强化免疫作用；低剂量 IL-2 具有免疫抑制作用。 | 升高常见于：类风湿关节炎(RA)、莱姆病、多发性硬化症(MS)、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM，l 型糖尿病)和慢性甲状腺炎。MS 活动期，IL-1、IL-2 和 IFN-γ 明显增加，恢复期时表现为 IL-4、IL-10 和 TGF-β 增加。 |
IFN-γ | 具有抗病毒生物活性；调节免疫和炎症应答，促进大部分细胞的激活、生长和分化。 | ||
TNF-α | 参与淋巴器官发生、炎症、抗肿瘤活性和宿主对细胞内病原体的防御。具有多种促炎特性，与脓毒症、炎症性和自身免疫性疾病有关。 | ||
Th2 型细胞 | IL-4 | 发挥抑制炎症反应的作用。 | 升高常见于：过敏性疾病、哮喘、硬皮病、系统性红斑狼疮(SLE)以及 HIV 感染。SLE 患者 TNF-α、IL-6、IL-8 和 IFN-γ 等促炎因子全身或局部的高表达造成组织炎性损伤。CD 活动期患者血清 IFN-γ、TNF-α 和 IL-6 水平明显高于缓解期和健康人群。 |
Il-6 | 重要炎症介质， IL-6 表达升高导致多种自身免疫性和炎症性疾病的发生。 | ||
IL-10 | 具有抗炎和免疫抑制的作用。 |
参考资料：
流式细胞术在风湿免疫疾病中有重要的应用，帮助我们及早对一些风湿免疫疾病进行诊断；在亚健康普遍化、社会老龄化的当下，可以对我们的免疫异常做出准确判断，及时帮助我们查找病因、纠正免疫异常、防止疾病的发生和恶化；对于身患风湿免疫疾病的“痛友”来说，可以监测病情和疗效，让医生更好地为我们制定治疗方案和疗程。
最后，祝大家形适外无恙、心恬内无忧、无痛一身轻！
此文仅供科普，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。
