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全自动外泌体荧光检测分析技术助力科学家开发出一种有效鼻腔新冠疫苗

发布时间: 2022-03-16 17:12 来源:QUANTUM量子科学仪器贸易(北京)有限公司

新冠疫情爆发以来,多种不同的疫苗(mRNA疫苗、慢病毒疫苗、灭活病毒等)在全的抗疫中发挥了重大作用。然而现有的疫苗也有一些局限性,如储存运输条件苛刻、需要接种加强针、对突变病毒不敏感等等。近,bioRxiv发表了一篇基于细菌外泌体的新型新冠疫苗对疾病保护作用的文章,或许可以为新冠疫苗的研发提供新的思路。


Jiang和Driedonks等[1]通过对细菌来源的外囊泡表面修饰病毒S蛋白的受体结合结构域(RBD)制成了新型新冠疫苗。革兰氏阴性菌能够产生外膜囊泡(OMV),在哺乳动物体内具有免疫刺激作用,可诱导免疫应答发生并激活树突细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞,而经过改造的工程菌产生的OMV内毒性非常低,避免了不良反应的发生。作者使用了一种鼠伤寒沙门氏菌株,通过Spycatcher/Spytag体系使该菌株分泌的OMV通过共价键稳定结合了病毒的RBD(图1)。


图1 (A)RBD重组抗原的设计,RBD连接到SpyTag的N端和C端;(B)RBD修饰的OMV示意图。


研究人员在RBD-OMV制备完成后,使用全自动外泌体荧光检测分析系统Exoview检测OMV表面是否成功结合了病毒RBD。其中,检测芯片上包被了D001, D003, MM43三种病毒S蛋白以及LPS的抗体,分别用于捕获RBD-OMV和所有OMV;捕获完成后使用荧光抗体标记对D001, D003, MM43进行表型分析。后,使用Exoview的SP-IRIS无标记成像技术检测了OMV是否被成功捕获,并通过荧光成像统计捕获的不同表型OMV的数量



图2 RBD-OMV捕获数量及表型检测。A:SP-IRIS技术检测不同抗体捕获的OMV数量;B:荧光检测不同表型OMV数量。

 


图3 对照组捕获数量及表型检测。A:SP-IRIS技术检测不同抗体捕获的OMV数量;B:荧光检测不同表型OMV数量。


 


图4 RBD-OMV与对照组的捕获的不同表型OMV数量对比。

 

图2A显示S蛋白抗体和LPS抗体均捕获到了数量相当的OMV,表示OMV以很高的效率成功结合了新冠病毒的RBD。图2B的荧光标记结果也证明了结合成功,但是结合D003的OMV数量相对较低。图3A和图3B的对照组结果表示仅有LPS抗体能够捕获到OMV,并且几乎没有荧光标记,表面对照组OMV上没有结合RBD,将RBD-OMV与对照组的数据统计对比(图4),说明RBD-OMV疫苗的特异性非常好。

 

RBD-OMV疫苗制备完成后,研究人员使用仓鼠模型对疫苗接种的效果进行了检测。实验分为三组:接种疫苗的实验组(RBD-OMV),接种溶剂的溶剂对照组(mock)和接种未结合RBD的OMV的空白对照组(Ctrl-OMV)。研究人员对不同组别分别接种后,使用病毒感染仓鼠,并进行了一系列测试以验证疫苗效果。



图5 RBD-OMV与mock、Ctrl-OMV的体重。A&B:接种完成后,病毒感染前的体重记录;C&D:病毒感染后的体重变化。

 

体重检测结果显示,在病毒感染前,三组仓鼠的体重,无论雄性和雌性,随时间均没有显著改变(图5A&B);病毒感染后,RBD-OMV组体重没有下降,而mock与Ctrl-OMV组体重下降,在第三、四天达到显著(图5C&D)。


 


图6 A:接种后Day42的抗S-RBD IgG滴度;B:抗S-RBD   IgG滴度随时间的变化;C&D&E:Day48的BAL中抗S-RBD   IgG/IgM/IgA的滴度;F:病毒中和抗体测试的中和抗体滴度随时间的变化;G:Day35 WT和Delta病毒株的中和抗体滴度比较。

 

血浆S-RBD IgG滴度测试结果显示,接种后42天,RBD-OMV组的血浆S-RBD   IgG滴度更高,而两个对照组的滴度位于检测限度以下(图6A)。为检测呼吸道黏膜的抗体水平,研究人员检测了肺泡灌洗液(BAL)的抗体滴度,RBD-OMV组中可检测到IgG/IgM/IgA,两个对照组则未检测到。中和抗体测试表明,WT病毒株感染的抗体滴度与14天开始上升,于28天达到峰值并可保持到35天(图6F);抗体的中和活性在Delta和WT中没有显著差异(图6G)。


 


图7A:肺部组织中的病毒滴度;B:BAL中的病毒滴度

 

TCID50检测结果显示,肺部组织(图7A)和BAL(图7B)中RBD-OMV组病毒滴度显著低于两个对照组,BAL组已达到检测低限度。

 


图8 A:Day48不同组别仓鼠的肺部形态;B&C:H&E染色结果及病变积分。

 

于48天处死仓鼠并分离肺部,肉眼观察可见RBD-OMV组的炎症和出血病灶少于两个对照组,具有更少的肺泡水肿(图8A);肺组织切片的H&E染色结果也显示,RBD-OMV组的炎症、出血病灶和肺泡萎陷更少,且雄性的病变积分更低(图8B&C)。

 

以上所有检测结果表明,这种RBD-OMV疫苗可诱导抗体分泌,分泌的抗体能够中和野生型和Delta亚种病毒,证明了疫苗具有保护作用。OMV等外泌体疫苗具有如下优势

  • 产量高:细菌复制快,且能够大量分泌OMV;

  • 多功能:表面可修饰多种抗原;

  • 组分构成简单:疫苗不需要其他佐剂;

  • 稳定性高:在室温下也能够保持稳定,可以冻干粉末的形式在低温长期保存。




以上结果说明,基于OMV的外泌体疫苗具有广泛的应用前景,可作为阻断新冠肺炎以及其他传染病传播的有效手段。

 

在这项研究中,作者使用Exoview系统对结合了重组RBD的OMV进行了表征分析,确定OMV上成功结合了新冠病毒的RBD。Exoview在外泌体疫苗开发中,可快速准确地表征外泌体,并统计不同表型外泌体数量并计算其比例,适合作为多组分外泌体疫苗的标准检测手段

 

   




参考文献:

 

[1]. Linglei Jiang, Tom Driedonks, Maggie Lowman,   Wouter S.P. Jong, ... & Kenneth W. Witwer. (2021). A bacterial   extracellular vesicle-based intranasal vaccine against SARS-CoV-2 protects   against disease and elicits neutralizing antibodies to wild-type virus and   Delta variant. bioRxiv. .


全自动外泌体荧光检测分析系统(ExoView R100)简介




作为外泌体表征分析的倡导者,美国NanoView Biosciences于2018年推出了全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView,该系统一经推出,便引起了外泌体领域科研工作者的广泛关注,凭借其稳定、出色的性能,短短几年在全球已有近百个客户,发表文献100多篇。ExoView的表征,能够帮助科学家更深入地了解外泌体与疾病之间的关系,助力疾病诊断和新药开发。

 

Nanoview所开发的全自动外泌体荧光检测分析系统(ExoView R200)采用单粒子干涉反射成像传感器(SP-IRIS)技术,是一款无需纯化的全自动的新型外泌体表征设备。该设备能够提供全方位的外泌体表征信息,包括颗粒大小、计数、表型与生物标志物共定位等,提供多层次和全面的外泌体测量解决方案。


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