LaVision BioTec 光片照明显微镜—实现人类胚胎细胞级分辨率的3D成像

LaVision BioTec 光片照明显微镜

1.     文献简述——Tridimensional Visualization and Analysis of Early Human Development 

虽然经过几个世纪的研究，人类的生长于发育过程中仍遗留有很多的未解之谜。人类胚胎发育的研究始于20世纪，一般以观察胚胎的组织图像的方式来研究如器官发生的机制等，传统的方式如切片一直使用至今。现今，对于胚胎3D图像的数字化构建也已经开始，使用核磁共振、X光摄影等方法均可获得胚胎的3D图像，但分辨率仍无法达到细胞水平。 

本研究使用了妊娠期6-14周的胚胎和胎儿共36个，结合免疫染色、3DISCO组织透明技术和光片照明技术，获得了人类胚胎细胞级分辨率的3D图像，清晰地显示了胚胎的外周神经、肌肉、血管、心、肺和泌尿系统。通过这种方法，我们可以建立人类生长发育的图库，研究人类胚胎发育的分子机制。

3D图像示例：

 1)    周围神经系统3D成像（使用中间纤维外周蛋白（Prph）的抗体标记Prph）：

（A）7周龄胚胎的表面造影图像（左）；对Prph进行标记所得图像。（B）8周龄胚胎的表面造影图像（灰色）和标记Prph所得图像（绿色）的叠加图像。（C）8周龄胚胎的面部神经分布。表面造影图像和标记Prph所得图像的叠加（中）（右）。 

感觉神经轴突和运动神经轴突在手脚的分布：分别使用胆碱乙酰转移酶（ChAT）和瞬态粘附糖蛋白-1（Tag-1）的抗体来标记。（D）在外周神经，染色产生重叠现象，但在末端Tag-1（绿色）更为明显。（D-F）ChAT染色与Prph和Tag-1均无重叠。

（D）9.5周龄的拇指，标记Prph和Tag-1。染色发生重叠，但在末端区域Tag-1更显著。（E）9.5周龄的左手，ChAT与Prph表达区域不同。（F）9周龄的右脚，ChAT与Tag-1表达区域不同。

（G）7周龄的头部，标记Prph显示颅神经。（右）对颅神经分布使用Imaris软件进行3D虚拟解剖、区分并着色。

 2)    手足的神经分布的3D成像： 

对Prph和Tag-1进行免疫染色以建立胚胎和胎儿手部的感觉神经及其分支的3D图像，并可观察感觉神经随时间推移的发育情况。

（A）8周龄标记Prph的右手，感觉神经分为尺骨神经、正中神经和桡神经。（B）右手从7周龄到11周龄的神经分布随时间的变化。肌皮神经（指针处）很快便延长深入手部。 

之后分别对ChAT和Tag-1标记，建立了运动和感觉神经的分布的图像，以确定两种神经在何处以何种方式分离。

（C）（D）9周龄的右脚和8周龄的左手的感觉神经和运动神经的3D图像。 

3)    对肌肉生长进行3D成像分析： 

转录因子Pax7是有颌下门动物的肌肉干细胞标记物，是肌肉生成的关键启动因子。在肌肉的生长中，表达Pax7的细胞均匀分布于生长中的肌肉，表达肌细胞生成素（Myog）的细胞成簇分布于运动神经末端。生长中的肌肉表达了双皮质素（Dcx），可能影响神经肌肉接点的发育。

（A）9.5周龄标记Pax7的右脚和右手。（B）10.5周龄标记Pax7与ChAT的右脚（C）9周龄标记Myog、ChAT和Tag-1的右脚。表达Myog的细胞成簇分布于运动神经分支末端。（D）9.5周龄的左脚标记Dcx与ChAT。Dcx在肌肉（*号）和感觉神经中检测到，但在运动神经轴突中未检测到。

（E）8周龄标记MHC与Tag-1的胚胎。（中上）动眼肌肉的图像。点状线标示出了肌肉的分界线，此处照明被色素上皮所减弱。（中下）肌肉与感觉神经。（右）左臂的肌肉与感觉神经。（F）9.5周龄标记MHC与ChAT的左手，显示了肌肉与运动神经。使用不同颜色对肌肉进行了区分，同时能够观察到正在发育的骨骼。 

4)    人类胚胎脉管系统的3D成像分析： 

质膜膜泡关联蛋白（Plvap）是一种由网状微血管内皮细胞表达的跨膜糖蛋白。对整个胚胎标记Plvap并成像，可以观察到致密的血管网络。对平滑肌表达的α肌动蛋白（SMA）进行免疫染色可以观察到生长中的动脉的3D结构。

（A）（B）8周龄标记Plvap的胚胎。Plvap在整个胚胎中形成了致密的网络。（A中、右）右臂与右手。（B左）左腿的Z轴投射图像。（*号）血管网络穿过了除了骨骼的所有组织。（B右）面部图像。（箭头）角膜处没有血管。（C）11周龄胎儿，标记胶原IV的肋骨表面。（D左）11.5周龄胎儿的右腿和右膝，标记MyoSM的动脉。（D右）11.5周龄胎儿的右脚，标记SMA的动脉。

对胃肠道的淋巴细胞表达的Podoplanin进行标记以研究淋巴管形成，表达Podoplanin的细胞覆盖了肠胃，而含Podoplanin的微管数量较少，说明人类淋巴系统成熟可能晚于血管系统。

（E）14周龄标记Podoplanin的消化道。表达Podoplanin的细胞位于肠胃上方。（右）表达Podoplanin的细胞尚未发育形成淋巴管。

5)    肺的生长发育的3D分析

标记鼠的性别决定基因Sox9转录因子和Dcx，观察到Sox9在人的末端支气管芽处表达，Dcx在每个气道的近端上皮部分表达。用Plvap标记肺部的血管，发现肺间质内微血管和大血管形成了连续的网络。肺部气道的分支方式是高度保守的，包括域分支、水平分支和垂直分支，使用Sox9/Dcx标记小支气管，可以观察到3种分支方式，并发现了不对称分支现象。

（A）9.5周龄标记Sox9、Dcx和Plvap的胎儿的肺部。Sox9在上皮小管的末端表达，Dcx在近端表达。Plvap在整个肺的血管中表达。（B）肺上皮小管Z轴光学切面。（C）末端的微血管网络。（D）气道分支的3D图像。肺叶（蓝绿），支气管（红）。（E）支气管的3D图像。（右）三种分支方式。 

标记SMA和平滑肌肌凝蛋白（MyoSM），两者均于围绕支气管和气道上皮小管的平滑肌处表达。标记Sox9显示出末端没有平滑肌。对平滑肌进行染色同时可以显示动脉和微动脉。可以使用SMA和酪氨酸羟化酶（TH）标记心脏来观察血管和神经分布。

（F）9.5周龄的标记MyoSM的肌凝蛋白平滑肌的染色。（箭头）支气管及分支。（G）11.5周龄的左肺标记SMA显示出气道平滑肌的分支方式。（箭头）动脉周围肌肉和（指针）近端气道周围肌肉。（H）10周龄的肺的分支图像。末端芽部用Sox9标记。表达SMA的平滑肌分布于不表达Sox9的近端区域。（I-K）心脏的光片显微图像。

6)    泌尿生殖系统发育的3D分析 

人类生殖道分为两种结构：由中肾分化而来的中肾管（WD）和由中肾管诱导分化而来的副中肾管（MD）。性别决定伴随着生殖道的重构。Pax2转录因子可用于标记中肾和WD。 

8周龄的雄性胚胎中，MD与WD紧密接触但并未完全生长。肾处于腹侧位置邻接生殖嵴。9.5周龄时MD继续沿WD延伸但并未连接。10周龄时两条MD连接，从两侧WD的中间延伸至泌尿生殖窦，同时开始降解，融合的剩余MD分化为前列腺囊。14周龄时，WD的中肾肾小管退化，附睾与输精管出现。Sox9是睾丸分化的必需因子，在睾丸索中表达，对Sox9使用免疫染色可以观察到睾丸索。

（A）8周龄标记Pax2的胚胎。（B）（箭头）MD/WD连接。（C）（D）9.5周龄的泌尿生殖系统。（箭头）MD尾端沿WD延长但仍未融合。（E）10周龄的泌尿生殖系统。MD在底端融合（指针）并开始降解（箭头）。（F）降解的继续。（G）14周龄的泌尿生殖系统。输精管进一步发育（指针）。（H）10周龄标记Pax2和Sox9的睾丸。（I）10周龄标记Pax2的睾丸。（J）14周龄的睾丸。 

10.5周龄的雌性胎儿，MD已经融合形成子宫阴道管。WD保持连续，但中肾小管开始降解。11.5周龄时WD和中肾的降解更加显著，两条MD延长。13周龄，WD末端已溶解，首端变为输卵管。发育过程中伴有性腺的血管新生。8周龄和10周龄的雄性胚胎和胎儿中，发育的睾丸和WD被致密的微血管所覆盖，MD则没有。而在10.5周龄的雌性胎儿中，MD和WD均已形成血管，13周龄时血管已紧密覆盖了MD，由此可知MD血管新生可能是性别相关的。雄性MD的降解可能与血管形成不足有关。

（A）10.5周龄标记Pax2的泌尿生殖系统。WD连续，MD已融合。（B）11.5周龄标记Pax2的生殖系统。（箭头）WD开始降解。（C）13周龄，标记Pax2的生殖系统。（箭头）子宫大小增加，WD显著降解。（右）MD发育中的输卵管纤毛。（D）8周龄标记Pax2和Plvap的睾丸。（指针）微血管覆盖了睾丸和WD。而MD却没有血管形成。（E）10周龄的雄性胎儿中，MD没有微血管形成。（F）（G）10.5和13周龄标记Pax2和Plvap的卵巢。WD和MD均有致密的血管覆盖。 

总结：将免疫标记与3D成像技术结合，能够完好地保存器官的3D结构并使分辨率达到细胞水平，简单、快速、稳定、可重复，以上这些优势适合其应用于胚胎学，可用于研究遗传疾病或畸胎。 

此方法的限制条件主要在材料的获得，同时使用得抗体数量，抗体与实验方法的兼容性和大容量数据的存储。然而其应用的广泛程度依然不可限量。以后甚至可用于建立人类生长发育的3D图库。 

2.     产品更新——光片显微镜专用折射率修正物镜 

对组织进行透明化需要注意，不同的透明化方式制作的样本折射率不同，需要使用相应折射率的成像液。为获得图像质量，物镜需要对特定折射率的样本进行优化。LaVision针对这一点开发了适用于不同折射率的物镜，能够应对各种透明化方式。 

LWDO系列 

LWDO系列物镜的工作距离更长，适用折射率：1.45-1.57。 

LWDO2x	LWDO4x	LWDO20x

LVMI系列 

LVMI系列的数值孔径更高，适用折射率范围较大：1.33-1.57 

LVMI 1x	LVMI 4x	LVMI 12x

Quantum量子科学仪器贸易（北京）有限公司作为LaVision BioTec GmbH在中国区域的合作伙伴，将持续为广大科研用户提供产品应用案例和技术前沿信息，有问题您也可以随时联系我们。

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