客户案例 | IF 11：摄入无酒精饮食也能醉酒？自动酿酒综合征临床多组学研究发现几株产乙醇的肠菌

自动酿酒综合征(Auto-brewery syndrome ,ABS)，也被称为肠道发酵综合征，是指病人在摄入无酒精高碳水化合物饮食后产生醉酒的状况。首个ABS病例报道于1894年的法国，此后不断有ABS患者被发现，传统认为其中相关微生物主要为真菌Candida spp.（念珠菌属）和Saccharomyces spp.（酵母菌属）。

现代研究发现，正常情况下，细胞代谢会产生少量内源性乙醇作为中间体或产物。在结肠的厌氧条件下，碳水化合物衍生的丙酮酸可以被代谢成乙醛，然后乙醛被还原成乙醇。这一过程有利于肠道细菌或酵母的过度生长和碳水化合物的过度消耗，由此产生的内源性乙醇被肠道和肝脏酒精脱氢酶(Adh)、过氧化氢酶和微粒体乙醇氧化系统迅速且几乎完全地从血液中清除。然而，当内源性乙醇超过肠道和肝脏的代谢能力时，就会在体内积累，导致血液酒精浓度(BAC)升高，进而发生ABS。

2023年4月，首都儿科研究所的袁静研究员、北京微生物流行病研究所的杨瑞馥教授、北京朝阳医院的王晶教授及团队在eBioMedicine（IF=11.1）期刊发表一项题为“Three Klebsiella species as potential pathobionts generating endogenous ethanol in a clinical cohort of patients with autobrewery syndrome: a case control study”的病例对照研究，通过多组学分析ABS患者肠道菌群特征及其与患者血液乙醇浓度的动态变化，证实克雷伯菌属产生的过量内源性乙醇是导致细菌性ABS的主要病因，联合使用抗生素、复方益生菌制剂及低碳水化合物饮食的治疗策略可有效缓解ABS。（麦特绘谱提供非靶向代谢组学检测分析）

研究团队此前报道一例抗真菌治疗无效的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)伴ABS的患者，并从患者中分离到高产酒精(HiAlc)的肺炎克雷伯菌，研究人员推断HiAlc肺炎克雷伯菌是细菌性ABS的致病因子，靶向肠道菌群针对性使用抗生素可有效控制真菌治疗无效的ABS患者的临床症状。本研究通过临床队列研究验证该菌在ABS的发生和发展中的作用机制。

肠道菌群及代谢组学分析

本研究纳入5名ABS患者和5名健康对照（HC）。粪便宏基因组学分析显示，与HC组比，ABS患者的肠道菌群失调，厚壁菌门丰度降低，变形菌门丰度增加，其中克雷伯菌属的丰度与患者血液中的乙醇浓度波动密切相关。非靶向代谢组学分析（麦特绘谱提供服务）筛选到77种差异代谢物，其中许多神经递质和特定代谢物（如γ-氨基丁酸、多巴、5-羟多巴胺、2,3-丁二醇、鹅去氧胆酸、酪氨酸、苯丙氨酸、苯甲醇、色氨酸和腐胺）在ABS发作时显著增加；相反，血清素和石胆酸的丰度降低。这些结果表明，神经递质类物质通过肠-脑轴介导的患者情绪发生变化类似于酒精中毒。

图1. ABS患者与健康对照的肠道菌群和代谢物比较分析

肠道菌群与BAC的动态变化及相关性

收集发病次数最多的ABS-2患者在不同时期（特别是治疗期间）的样本进行血液酒精浓度监测和粪便宏基因组学分析，结果显示，该患者每次发病时的BAC达到300-400mg/dL(65 mmol/L- 87 mmol/L，相当于15杯酒精含量为40%的威士忌)。通过饮食控制和益生菌干预措施后，该患者前期暂时性改善，随后逐渐恢复原状。进一步分析发现肠杆菌科的5个菌属的分布与BAC波动密切相关，包括克雷伯菌、大肠杆菌、志贺氏杆菌、沙门氏菌和肠杆菌，当BAC 在发病状态 (S2) 期间达到 400 mg/dL时，几乎是发病前样本或健康对照样本的60倍。随后对粪便样本分离到的5种菌属的细菌进行产乙醇能力检测，发现HiAlc克雷伯菌属的产乙醇能力最高，说明克雷伯菌可能是ABS的潜在致病因素。

图2. 患者肠道菌群与血液酒精浓度的相关性

体内体外实验证实HiAlc克雷伯菌通过产生内源性乙醇促进ABS的发生

首先通过发酵培养检测ABS患者肠道不同部位灌洗液的乙醇浓度，结果显示在肠道灌洗液中检测到高浓度乙醇，同时存在克雷伯菌，其在高浓度酒精的部位丰度更高。进一步从ABS-2患者的小肠、结肠和粪便中分离出 17 株 HiAlc 克雷伯菌，选取产酒精能力最强的三种菌株进行生理特性分析，发现这些菌株具有透明的荚膜、较强的生物膜形成能力，以及更快的生长速度。培养实验表明，这些菌株的产乙醇能力与碳源和环境氧气条件有关。

随后建立了家兔肠道培养模型以验证HiAlc克雷伯菌在体内能否产生酒精。结果显示，在每个菌株培养4小时后，家兔肠道内、结肠粘液和体外培养的乙醇浓度相当，与标准菌株ATCC 2146相比，所有三株HiAlc克雷伯菌在体内都具有较强的产乙醇能力。进而一步构建小鼠模型证实HiAlc克雷伯菌在体内可产生大量内源性乙醇来诱导ABS发生，表明该菌是ABS发作的重要致病菌。

图3. ABS患者肠道不同部位的产乙醇能力及分离出的HiAlc克雷伯菌的特征

诱导HiAlc克雷伯氏菌产生酒精的膳食成分的鉴定

将5名ABS患者发病及恢复期和5名HC的粪便样本在含有不同浓度碳水化合物或蛋白质的培养基中培养，结果发现在含有不同单糖培养基中，ABS患者发病期的粪便菌群可产生高达 35 mmol/L 的乙醇，而在用含有其他底物的培养基培养的同样菌群时，酒精浓度要低得多（<10 mmol/L）。此外，ABS 患者恢复期以及HC组粪便菌群产乙醇浓度较低。这些结果表明单糖可以快速诱导HiAlc 克雷伯菌发酵产生乙醇，是ABS发作的重要食物诱因。

图4. 不同膳食成分诱导因素评估

靶向肠道菌群治疗的临床验证

最后以ABS-2患者为例分析肠道菌群对不同抗生素的敏感性，其中左氧氟沙星和亚胺培南的使用显着降低了肠道菌群的产酒能力，并且这两种抗生素存在时，发酵的主要副产物短链脂肪酸（例如乙酸、丙酸、丁酸和戊酸）也显著减少，克雷伯菌丰度显著降低。基于此，对ABS-2患者进行微生物群相关治疗：补充15%氨基酸和维生素C注射液(250 mL/天)3天后，患者饮食被限制为无糖和无碳水化合物，在医院口服抗生素(左氧氟沙星500 mg/天)治疗1周后，患者中毒症状逐渐消退。随后根据患者与健康对照者之间差异菌群，使用益生菌进行肠道菌群重建，益生菌为含有26种乳酸杆菌的商业复合益生菌和一种含有丁酸梭菌和芽孢杆菌的益生菌。期间患者BAC在0-13 mmol/L持续波动并最终降至0 mmol/L，同时，克雷伯菌的拷贝数也显著降低。

图5. 抗生素治疗对肠道菌群的作用

小结

综上，本研究报道了细菌性ABS的肠道菌群特征、动态变化以及治疗效果。研究结果证实，一些肠道细菌通过产生大量内源性酒精而过度生长导致ABS的发生。使用适当的抗生素加上复杂的益生菌制剂和控制饮食能够有效治疗细菌性ABS。此外，内源性乙醇的产生不仅对ABS很重要，而且对NASH和许多其他疾病也很重要。本研究的方法将有助于临床医生对ABS进行精确诊断，并为ABS的替代治疗策略的研究提供新的途径。

图6. 细菌性ABS的产生机制

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客户案例原文

Xue G, et al. Three Klebsiella species as potential pathobionts generating endogenous ethanol in a clinical cohort of patients with auto-brewery syndrome: a case control study. EBioMedicine. 2023.

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