大鼠骨髓间充质干细胞原代培养

实验动物

SD大鼠，2周龄，若干，购于第三军医大学实验动物中心。

实验步骤

1.无菌操作注意事项

细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，操作时不能大声说话，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

2.细胞生长培养基的制备

培养基在使用前需加入10%的胎牛血清和双抗，一般为血清。培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。 

按细胞生长需求，制备相应的生长培养基。一般的细胞生长培养基为培养基+10%胎牛血清，最后按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 U／mL。

3.大鼠骨髓间充质干细胞的分离

（1）取SD大鼠，颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

（2）碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉，PBS溶液冲洗两遍。

（3）从中间剪断股骨和胫骨（我们选择的2周龄老鼠，骨头较嫩，可不用将两段剪掉，直接用针头刺穿冲洗；也可用血管钳将股段夹碎，然后反复冲洗或震荡漂洗），用2ml无菌注射器吸取DMEM/F12溶液冲出骨髓细胞多次，再用针头吹打，吸管吸入离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，用PBS重悬细胞。

（4）缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面，保持二者分层界面。

（5）2000rpm离心15-25min，离心后溶液分4层，吸取中间骨髓基质细胞层（白色浑浊状），PBS洗三次。

（6）用含15%胎牛血清及青链霉素的DMEM/F12以10⁶/mL的细胞浓度接种于625px2培养瓶中，置37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养。（注：血清浓度可适量高点，有利于细胞增殖，但太高，细胞容易老化，血清的质量也会影响细胞状态）

（7）24小时后弃去培养液（看细胞贴壁情况），PBS冲洗 2-3次去除未贴壁细胞，加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次，一般10d细胞生长融合。（注：我们一般24h就换液了，细胞圆形的杂细胞会比较少；细胞少的时候不一定让其长满整个培养皿，只要集落已经很大了，集落中心很密集就可以传代了）

（8）经0.25%胰酶消化，1：2传代（接种密度1*10⁵/cm²），其后一般3-5d传代1次，选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。（注：细胞密度不能太低，否则长得比较慢）

细胞形态

骨髓间充质细胞原代培养过程中，约24小时即可出现贴壁生长，细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显，出现以梭形为主的多种形态，10-14天70%-80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一，呈梭形或扁平型，增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列。

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