原代细胞培养

原代细胞培养（小鼠巨噬、小胶质/大鼠肝细胞等）

威斯腾生物经过10多年的发展，获得了上百种细胞株和四十余种原代细胞培养经验，并建立了庞大的细胞库及原代培养资料库。细胞平台有资深实验员、规范的SOP操作文件，万级净化细胞房，这些条件为保质保量完成每个客户的实验提供了保障。 同时，威斯腾生物结合多年原代及传代细胞培养经验，结合平台已有的技术优势，建立了完善的体外药筛实验，并引进RTCA(Real-time cellular Analysis，实时无标记细胞记录仪），在药筛过程中，全程实时记录细胞真实状况，为药筛提供最真实精准的实验数据。

无菌操作注意事项

细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，操作时不能大声说话，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。

小鼠巨噬细胞的原代分离培养

培养板的包被

（1）将盖玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小，洗涤剂浸洗、烘干。

（2）经 5%盐酸浸泡30min，自来水冲洗20min，三蒸水冲洗，浸泡过夜并烘干；移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精灯烤干，放入 24 孔细胞培养板。

（3）用 0.01%的 L-多聚赖氨酸溶液包被培养皿和小玻片，37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。 吸弃L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。 

小鼠巨噬细胞的分离及培养

 (1) 实验开始前向小鼠腹腔注射0.5ml含40μg刀豆球蛋白a的磷酸盐缓冲液（PBS）。

 (2) 3天后，断颈处死小鼠，75%酒精消毒小鼠皮肤。

 (3) 置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。

 (4) 再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml 无菌PBS液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。

 (5) 用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。

 (6) 小心拔出针头，把液体注入离心管中，1000r/min 4℃离心10分钟，弃去上清液，重复两次，加入完全培养液重悬。

 (7) 将滤液进行台盼蓝拒染试验,血细胞计数板镜下计数。以 8.0 ×104至 1.0 ×105/mL的密度将细胞以 400µl/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24 孔培养板或 100µl/孔接种 96 孔培养板。

 (8) 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，细胞培养24-48 h直到融合。

 小鼠小胶质细胞的原代分离培养

 培养板的包被

 （1）将盖玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小，浸洗、烘干。

 （2）经 5%盐酸浸泡30min，自来水冲洗20min，三蒸水冲洗，浸泡过夜并烘干；移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精灯烤干，放入 24 孔细胞培养板。

 （3）用 0.01%的 L-多聚赖氨酸溶液包被培养皿和小玻片，37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。去除 L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。

 小鼠小胶质细胞的混合培养

 (1) 75%（体积分数）酒精消毒新生 24h 内的清洁级小鼠，在无菌条件下断头，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2,无钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。

 (2) 无菌剥离脑组织，除去小脑、海马、大脑髓质,分离大脑皮层，仔细剥离脑膜及血管。

 (3) 用虹膜剪将组织剪切成 1mm3左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 20min，期间振摇 2～3 次。

 （4）弃去上清液，加入完全接种液终止消化，漂洗两次。巴斯德吸管轻轻吹打至肉眼观察无明显的脑组织团块，静置 2min。

 （5）悬液收集于新的离心管，离心（1000r/min，10 min，4℃），弃去上清液。加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。根据实验需要接种于若干个25cm细胞培养瓶或培养皿中。

 （6）置 37℃、5%CO2培养箱培养24h后更换一次培养基，以后每3d换一次液，并在镜下观察细胞的生长和存活情况。

 小胶质细胞的分离和纯化 

（1）细胞培养14～16d左右,在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞培养物中出现细胞分层现象, 即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的星型胶质细胞,小胶质细胞明显偏小呈类圆形、折光性强,附着于星型胶质细胞表面生长。

 （2）倒掉培养液,用0.05%胰酶2～3mL消化,边观察边轻轻晃动培养瓶,等到贴附在星形胶质细胞上的小胶质细胞脱离下来,将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入10mL离心管，立刻用完全培养基终止消化。

 （3）离心管配平,1000r/min, 离心5min, 弃上清；加定量完全培养再次吹打成细胞悬液,接种于预先包被的置有盖玻片的24孔培养板,置于CO2恒温细胞培养箱(37度)培养。

 （4）生长24h后吸掉培养液,以去除未贴壁的少突胶质细胞,加完全培养液继续培养。

 大鼠肝细胞原代分离培养

 （1）麻醉及灌流：将大鼠以7% CCI₃CH(OH)₂（0.5ml/100g）麻醉，75%乙醇消毒后移至工作台，0.45mm头皮针连接蠕动泵，打开蠕动泵，调整蠕动泵灌流速度为7ml/min，抽取37℃预热的灌流液I并排空装置内的空气。打开腹腔，将胃肠结构推向左腹上侧，分离出下腔静脉（肾上段）、肝门静脉，剪开隔膜，动脉夹夹闭下腔静脉肝上段，将头皮针插入下腔静脉（肾上段），动脉夹夹闭固定，打开蠕动泵，灌注37℃预热的灌流液I，确定肝脏均匀膨胀后剪开肝门静脉，继续灌流至肝脏变成土黄色且肝门静脉剪断处流出无色灌流液为止，更换预先预热的37℃灌流液II，直至肝脏表面出现白色裂纹时停止灌流。剪下肝脏，置于无菌D-Hanks溶液中。

 （2）肝细胞的收集：将肝脏在PBS溶液中洗2次，然后放入高糖DMEM培养基中，眼科镊撕开肝包膜，此时肝细胞会分散在培养基中，然后用200目不锈钢细胞筛过滤，将滤液转移至15ml无菌离心管。 

 （3）肝细胞纯化：将收集的滤液以800rpm离心5min，弃去上清，用高糖DMEM完全培养基重悬细胞，用200目不锈钢细胞筛再次过滤，离心收集细胞沉淀。用高糖DMEM肝细胞生长培养液重悬细胞。

 （4）肝细胞计数及活力检测：取0.1ml肝细胞悬液与0.1ml PBS、0.1 ml40g/l的台盼蓝储备液混合后，用血细胞计数板计数收获的肝细胞总量及存活率。

 （5）将肝细胞悬液调整细胞5x105/ml接种于铺有鼠尾胶原的培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24h后换液，用高糖DMEM肝细胞生长培养液继续培养。后续隔天换液培养。

威斯腾实验服务流程

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