mRNA-seq项目文章|棕榈酰转移酶ZDHHC21调节氧化磷酸化诱导AML分化阻滞和干性

急性髓性白血病(AML)是一种侵袭性血液系统恶性肿瘤。接受最密集治疗的患者中有近50%不可避免地会复发，可能是由于耐药白血病干细胞(LSCs)的持续存在。AML细胞(尤其是LSCs)高度依赖线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)存活，但OXPHOS过度活跃的机制尚不清楚，也缺乏抑制OXPHOS的非细胞毒性策略。本研究首次证明棕榈酰转移酶ZDHHC21是AML细胞中OXPHOS高活性的关键调节因子，ZDHHC21的缺失/抵抗可以通过抑制在AML细胞中的OXPHOS有效地诱导了骨髓分化并削弱了干性潜力。同时，FLT3-ITD突变的AML细胞表达了更高水平的ZDHHC21，并且对ZDHHC21抑制表现出更好的敏感性。在机制上，ZDHHC21特异性催化线粒体激酶AK2的棕榈酰化，并进一步激活白血病母细胞中的OXPHOS。

抑制ZDHHC21可抑制AML细胞的体内生长，延长AML细胞系和PDX-AML原细胞接种小鼠的存活时间。此外，靶向ZDHHC21抑制OXPHOS可显著消除AML原细胞，提高复发/难治性白血病的化疗效果。总之，这些发现不仅揭示了棕榈酰基转移酶ZDHHC21在调节AML氧化磷酸化中的新的生物学功能，而且还表明抑制ZDHHC21是AML患者，特别是复发/难治性白血病患者的一种有前景的治疗方案。

mRNA-seq

1. 高表达的ZDHHC21特异性调控AML细胞中的OXPHOS活性

首先，我们表征了白血病原始细胞线粒体ATP的产生，以确认AML的生物能量状态，发现白血病原始细胞的ATP水平远高于正常骨髓细胞(图1A )。然后，我们建立了基于ATP的检测方法，在AML细胞而非HSCs中筛选特异性抑制OXPHOS的信号(图1B )。如Fig 1C所示，线粒体复合物I的抑制剂鱼藤酮和IACS - 010759确实显著抑制AML细胞( HL60 )中的ATP水平，但也强烈抑制HSCs中的ATP水平。令人兴奋的是，在267个PTM抑制剂中，有16个化合物选择性抑制AML细胞而非HSC细胞中的OXPHOS，其中ZDHHC棕榈酰转移酶家族抑制剂2BP的作用最强。这些结果表明ZDHHC棕榈酰转移酶抑制剂可以选择性地调节AML细胞中的OXPHOS。为了确定哪些ZDHHC可能参与OXPHOS的调控，我们引入了针对23个ZDHHC的siRNA。结果显示，只有ZDHHC21选择性抑制AML细胞中的ATP水平，而不抑制HSCs中的ATP水平( Fig 1F )。随后我们发现，AML细胞中相对于正常细胞上调最显著的前3个ZDHHCs分别是ZDHHC1、ZDHHC21和ZDHHC23(图1H)。在所有癌种中，ZDHHC21在AML中表达最高，而ZDHHC1和ZDHHC23在AML中表达较低(图1I )，这可能有利于ZDHHC21在AML细胞中调控OXPHOS的特异性。

2. ZDHHC21激活OXPHOS抑制AML细胞的髓系分化

为了阐明ZDHHC21在AML进展中的远程作用，我们进行了基因集富集分析( Gene Set Enrichment Analysis，GSEA )，发现在ZDHHC21高表达的患者中，通常在HSCs中上调而在髓系细胞发育中下调的基因高度富集(图2A )。然后，在shZDHHC21转染的AML细胞中进行RNA测序，结果显示，在第4天和第7天，shZDHHC21引起的693个改变的基因高度富集在分化相关和成熟相关的簇(图2B)中。sh ZDHHC21细胞中的差异表达基因也与HSCs中通常下调而髓系细胞发育中上调的基因相匹配。这些结果提示ZDHHC21可能在髓系分化中发挥作用。为了进一步研究ZDHHC21调控的OXPHOS在髓系分化中的远端效应，我们分析了ZDHHC21的动态表达以及OXPHOS水平在HSCs不同成熟阶段的变化。如Fig 2C所示，随着HSCs的分化成熟，ZDHHC21逐渐降低，而在AML细胞中ZDHHC21持续高表达。

3. ZDHHC21调控LSCs的干性潜能和AML细胞的化疗耐药

shZDHHC21显著抑制LSCs的增殖和克隆形成能力，而对HSCs的增殖和克隆形成能力没有影响。在2BP处理(图3I - K)后，LSCs中的OXPHOS、细胞增殖和集落形成能力也观察到类似的选择性抑制作用，而HSCs中没有观察到类似的选择性抑制作用。这些结果表明，ZDHHC21缺失/抑制显著削弱了LSCs的干性潜能，且靶向ZDHHC21对HSCs的毒性最小。更重要的是，高OXPHOS的初治AML样本对化疗敏感性较差，包括标准治疗药物阿糖胞苷和阿霉素，以及其他化疗药物。

4. ZDHHC21诱导的AML增殖、干性和分化阻滞依赖于其棕榈酰酰基转移酶活性

作为一种棕榈酰转移酶，我们想知道ZDHHC21对AML恶性进展的调控作用是否依赖于其酶活性。首先，我们构建了小鼠ZDHHC21 ( mZDHHC21 )及其催化失活突变体( C120S )，并在ZDHHC21敲低的细胞中重新表达(图4A )。如预期的那样，sh ZDHHC21明显抑制了AML细胞的增殖，m ZDHHC21过表达而非m ZDHHC21 ( C120S )挽救了sh ZDHHC21诱导的(图4B)表型。此外，过表达mZDHHC21可以恢复shZDHHC21抑制的AML细胞在软琼脂中的克隆形成能力，但不能恢复mZDHHC21 ( C120S ) (图4C)的克隆形成能力。更重要的是，我们确定了这些细胞在体内的生长情况。结果显示，sh ZDHHC21明显抑制肿瘤生长，m ZDHHC21过表达可以挽救sh ZDHHC21对肿瘤生长的抑制作用，而m ZDHHC21 ( C120S ) (图4F - G)不能挽救sh ZDHHC21对肿瘤生长的抑制作用。因此，这些结果表明ZDHHC21的棕榈酰转移酶活性是其在AML细胞中发挥调控功能所必需的。

5. shZDHHC21在AML中表现出较强的治疗作用，并延长白血病小鼠的生存期，靶向ZDHHC21是复发/难治AML的潜在治疗策略

我们首先将HL60 - shCtrl或HL60 - shZDHHC21细胞静脉移植到NOD/SCID小鼠中。shZDHHC21显著抑制了白血病总体负荷(图5A和S20A)和因白血病发生导致的体重下降(图5B )。与shCtrl细胞相比，shZDHHC21细胞移植组小鼠的总生存期显著延长( Fig 5C )。接下来，我们在HL60皮下移植瘤小鼠模型中评估了ZDHHC21抑制的抗肿瘤活性。shZDHHC21 -慢病毒显著抑制肿瘤生长，降低肿瘤重量(图5D - E)。shZDHHC21显示出明显的治疗活性，没有观察到明显的体重下降。此外，与shCtrl组相比，HL60 - shZDHHC21细胞移植瘤中CD11b和CD14表达上调(图5F )。

由于ZDHHC21可以调节LSC的维持和化疗耐药，我们想知道靶向ZDHHC21是否可以治疗复发/难治性AML。首先，我们在复发/难治的PDX - AML移植瘤模型中评估了ZDHHC21抑制的效果。从携带FLT3ITD的复发/难治AML患者中分离AML原始细胞，将sh Ctrl或sh ZDHHC21慢病毒感染的原始细胞移植到NSG小鼠体内。感染sh Ctrl病毒的囊胚移植28 d后，由于白血病的发生，体重减轻明显，而sh ZDHHC21组则没有(图6A )。值得注意的是，shZDHHC21组的总生存时间明显延长(图6B )。与此一致，sh ZDHHC21组表现出更低的白血病植入水平(图6C )和更低的脾脏重量(图67D )。此外，从脾脏中提取的细胞显示CD34+细胞比例细胞减少，sh ZDHHC21组白血病细胞CD11b表达高于s组，为了进一步证实2BP在临床上对化疗的潜在增敏作用，我们从3例药物敏感和3例难治患者中分离出原代AML原始细胞。与药物敏感样品相比，2BP显著增强Ara - C诱导的细胞凋亡，促进难治细胞对Ara - C的再敏化。此外，2BP还增强Ara - C诱导的LSCs凋亡。总之，这些结果强烈表明ZDHHC21是复发/难治性AML的一个有希望的靶点。

综上所述，该研究揭示了棕榈酰转移酶ZDHHC21调控AML特别是LSC细胞线粒体氧化磷酸化的全新生物学功能，也提出抑制ZDHHC21作为儿童AML尤其是复发/难治患儿的潜在治疗策略，为儿童白血病的临床治疗提供全新药物靶点和思路。

参考文献：

Shao X, Xu A, Du W, Xu T, Huang Y, Xia Z, Wang W, Cai M, Zhang X, Zhang J, Cao J, Xu X, Yang B, He Q, Ying M. The palmitoyltransferase ZDHHC21 regulates oxidative phosphorylation to induce differentiation block and stemness in AML. Blood. 2023 Jul 27;142(4):365-381. doi: 10.1182/blood.2022019056. PMID: 37216691.