mRNA-seq项目文章 | 钼酸钙纳米颗粒3D生物打印于毛发再生的研究

皮肤缺损区毛囊的再生仍然是世界各地的一个巨大挑战。由于毛囊采集困难，目前还没有有效的策略来解决这一问题。在此，作者设计了一种基于钼酸钙（CM）纳米颗粒的生物墨水，其中含有真皮乳头细胞（DPCs）和巨噬细胞。通过释放钼（Mo）离子，建立了一个抗炎的微环境，从而实现了对生物活性离子介导的毛发再生的良好免疫调节。研究表明，在含有CM纳米颗粒的多细胞生物墨水中，Mo将巨噬细胞极化为M2表型，从而抑制抗炎细胞因子。此外，该支架的抗炎免疫微环境诱导DPCs分泌毛囊生长原相关细胞因子，促进体内毛发再生。最后，转录组学分析揭示了Mo激活巨噬细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路并上调生长因子（HGF和IGF-1）的表达的潜在机制。通过裸鼠创面、皮下植入和小鼠的雄激素脱发三种动物模型证实了该支架的免疫调节和诱导毛发再生作用。

mRNA-seq

1.含钼酸钙（CM）纳米颗粒生物墨水的制备和细胞活性

开发了一种具有毛囊再生功能的新型生物墨水，将CM纳米颗粒与不同浓度的GG（gelatin + GelMA）基质生物墨水混合，制备生物墨水。本研究采用DPCs和巨噬细胞（RAW 264.7 cells），研究免疫调节对毛发再生的机制。随着培养时间的延长，细胞生长良好并增殖。同时研究了单培养支架中DPCs的基因相对表达水平（图1c）。PDGF-A、PDGF-B、C-Myc、VEGF的表达跟0CM-GG-D组相比，50CM-GG-D组、250CMGG-D组和500CM-GG-D组上调。PDGF已被证明在卵泡发育和血管生成中至关重要。PDGF-A和PDGF-B作为PDGF家族的两个主要成员，可以诱导和维持头发循环的生长期。综上所述，CM有利于DPCs毛囊生相关基因的表达。

为了研究CM纳米颗粒介导的免疫环境，将RAW 264.7细胞加入到生物墨水中，制备了一系列支架。培养21天后，RAW 264.7细胞在含50和250 μg/mL CM的单培养支架中的增殖作用明显高于无CM的支架。（图1d)。对支架中的RAW 264.7细胞进行分离、收集，并进行免疫染色，分析CD206的表达情况。与0CM-GG-D组相比，50CM-GG-D、250CM-GG-D和500组CD206的荧光强度明显上调。其中，250CM-GG-D组的CD206表达最强。基因分析的结果与免疫荧光染色图像一致这些结果表明，CM能够触发更多的M2巨噬细胞标记物和抗炎细胞因子的产生，显示出CM在刺激巨噬细胞向抗炎M2表型方面的显著有效性。

2. 生物打印多细胞支架对细胞行为的调节作用

将CM纳米颗粒加入到浓度为250 μg/mL（250CM-GG）的生物墨水中，之后将DPCs和RAW 264.7细胞分别加入到生物墨水中。接下来，打印了一系列不同细胞比例的多细胞支架：RAW 264.7细胞数量为DPCs细胞数量的1/2（Co-D-1/2 R）、1/3（Co-D-1/3 R）和1/5（Co-D-1/5 R）。选择仅含DPCs的支架作为对照组（Mono-D）。在培养7天后，检测支架中细胞的相关基因表达情况。PDGF-A、PDGF-B、C-Myc和VEGF的表达明显高于Mono-d组。生长因子，如肝细胞生长因子（HGF）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1），在脱发治疗中发挥了重要作用，因此，还检测了RAW 264.7细胞在多细胞支架中的HGF和IGF-1基因的表达。发现Co-D-1/3 R诱导了良好的免疫微环境，从而促进了分泌与促进毛囊再生相关的细胞因子。

3. CM诱导免疫调节作用的作用机制

为了探讨Mo离子对巨噬细胞免疫调节作用的潜在机制，分别制备了仅含有RAW 264.7细胞（简称3D-R-control）和同时含有RAW 264.7细胞和CM的3D支架（简称3D-R-CM）。培养7天后进行转录组测序。主成分分析（PCA）显示，差异基因表达与CM的存在与否显著相关，提示RAW 264.7细胞的基因表达可以被CM的支架调控。比较了两组差异表达基因（DEGs），热图和火山图显示，3D-R-CM中有756个上调基因和1638个下调基因，表明基因表达差异范围广泛。然后，进行GO分析，探讨其生物学功能可能会影响细胞凋亡和巨噬细胞分泌生长因子等生物过程等。对DEGs进行KEGG富集分析，mTOR、PPAR信号在上调的通路，已被证实与M2表型激活有关。相反，M1表型激活相关通路如TNF和MAPK信号通路在下调的通路中。

CM的加入可显著促进M2表型相关基因和毛囊生长期相关基因。加入mTOR抑制剂后，基因表达水平下调到未加入CM的对照组。RAW 264.7细胞中IRS1、PI3K、mTOR、Rho和ROCK2的基因表达受到CM刺激的正调控，这些关键分子表明了mTOR通路的激活。因此，Mo离子激活的mTOR信号通路在免疫调节性毛发再生中起到了重要作用。

4. 生物打印多细胞支架对体内毛囊再生和伤口愈合的影响

首先研究了该支架对裸鼠皮肤缺损模型中创面愈合和毛囊再生的影响。将这些支架移植到裸鼠的急性皮肤创面（10 mm）上。将裸鼠随机分为5组：无支架（Blank）、不含DPCs和CM的支架（GG）、仅含DPCs的支架（GG-D）支架、含CM和DPCs的支架（CM-GG-D）、含CM、DPCs和RAW 264.7细胞的支架（CM-GG-Co、DPCs和RAW 264.7细胞，比例为3：1）。14天内不同时间点的创面宏观照片和创面面积统计图，说明GG-D、CM-GG-D、CM-GG-Co组均表现出良好的创面愈合效果。空白组在第14天显示未完全上皮化，明显未愈合的缺损。特别是CM-GG-Co组的创面缺损完全闭合。体外实验结果表明，含CM的支架可诱导M2巨噬细胞极化，并在伤口周围建立抗炎微环境。当小鼠饲养到40天时，CM-GG-D和CM-GG-Co处理的小鼠背部有新生毛发，而Blank组、GG组和GG-D组没有毛发。值得注意的是，与CM-GG-D组相比，CM-GG-Co组实现了更多的毛囊和毛发再生。提示RAW 264.7细胞与DPCs相互作用所诱导的治疗效果优于单独作用的DPCs。

为了研究CM的免疫调节作用，对生物3D打印进行了皮下植入。ELISA检测第4天和第7天支架周围组织中TNF-a、IL-4、KGF、PDGF-A和C-Myc的分泌水平。与预期的一样，用含有CM的支架（CM-GG-D和CM-GG-Co）处理的组织在第4天和第7天分泌的促炎细胞因子TNF-a要少得多，但分泌的抗炎IL-4更多。用含有DPCs的支架处理的组织在第4天分泌了更多的KGF、PDGF-A和C-Myc。与第4天相比，ELISA结果在第7天有更明显的变化趋势。

为进一步证实毛囊再生效果，并通过肉眼观察毛发再生情况，建立了雄激素性脱发（AGA）小鼠模型。同样，AGA小鼠随机分为5组：无支架（Blank）、无DPCs和CM的支架（GG）的支架、含DPCs和RAW 264.7细胞（GG-Co）的支架、含CM的支架（CM-GG）、含CM、DPCs和RAW 264.7细胞的支架（CM-GG-Co、DPCs和RAW 264.7细胞，比例为3：7）。随着时间的推移，毛发再生状态的视觉外观显示，Blank组和GG组直到第40天才没有明显的新生毛发，而其他组，特别是CM-GG-Co处理的小鼠再生了大量的毛发，CM-GG-Co获得了最显著的再生毛发覆盖度。CM-GGCo组在细胞增殖、毛囊形成和毛发再生等各个阶段均表现出明显的优势。总的来说，所获得的含有CM的多细胞支架具有免疫调节和体内毛发再生的能力，这是重建复杂皮肤附件的新策略的重大进展。