转录组测序项目文章|人类肠道卵形拟杆菌在膳食纤维素糖降解中重要作用

纤维素是植物细胞壁的主要成分之一，是一种复杂的多糖，由β1，4-糖苷键连接的D-吡喃葡萄糖基残基骨架组成。纤维素在哺乳动物的肠道中既不能被消化也不能被吸收，只有通过纤维素溶解的微生物与其宿主之间建立的共生关系才能被降解。越来越多的证据表明，纤维素可以被反刍食草哺乳动物和杂食哺乳动物（包括人类）共生的纤维素溶解的细菌消化。

由人类肠道微生物基因组可编码并分泌纤维素酶，该酶可以消化纤维二糖。目前，针对纤维素酶研究或是纤维素溶解的分子机制尚不明确。

RNA-seq，16S rRNA sequencing

本文使用纤维二糖作为造模剂，其能促进人类肠道关键菌群（如：卵形拟杆菌（Bacteroides ovatus，BO））生长从而进一步研究共生机制。采用RNA-seq发现可能存在的新酶；同时，我们还通过16S rRNA测序分析了纤维素糖对小鼠肠道菌群组成的影响。

发现了BO的一个新的多糖利用位点（polysaccharide utilization locus，PUL），PUL参与了纤维二糖的捕获和降解。此外，还检测细胞表面上两种新的纤维素酶BACOVA_02626^GH5和BACOVA_0630^GH5，两种酶能将纤维二糖降解为葡萄糖。

1. 纤维二糖促进卵形拟杆菌和益生菌的生长

分别用纤维二糖和纤维四糖处理不同细菌进行对比，设计3个分组：卵形拟杆菌组（Bacteroides ovatus，BO），纤维素类杆菌组（Bacteroides cellulosilyticus，BC）和益生菌组（ 包含：罗伊乳杆菌（Lactobacillus reuteri，LR）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus，LGG）、长双歧杆菌（Bifidobacterium longum，BL））。

实验结果显示BO在2.5 mg/mL和5 mg/mL纤维二糖上生长良好。BC生长非常缓慢，并且在纤维二糖培养96 h，最大OD600值几乎只有在BO的一半。益生菌组在5 mg/mL纤维二糖上生长良好，58 h时最大OD600值分别约为1、0.7和0.5。结果表明，BO在5 mg/mL纤维四糖上能短时间生长，24 h时最大OD 600值约为0.4。然而，BC组和益生菌组均不能在纤维素上生长。

2. 纤维素二糖被卵形拟杆菌降解为葡萄糖

为了探索纤维二糖是否能降解为葡萄糖，采用纤维二糖与BO共培养的上清液，通过薄层色谱（TLC）分析。然而，无法从上清液中检测到葡萄糖。因此，考虑认为纤维二糖可能被转运到细胞中以进一步消化降解。后续设计BO与葡萄糖（作为A组）或纤维二糖（作为B组）分别进行共培养，同时利用蛋白酶K破坏细胞膜进行对比。结果显示，在A组中不能检测到葡萄糖，而在B组中可以检测到葡萄糖，而用蛋白酶K处理6 h的细胞产生的葡萄糖较少，用蛋白酶K处理12 h后没有产生葡萄糖。上述结果表明纤维二糖被BO降解为葡萄糖，而降解过程依赖的酶可能定位在细胞膜上。

3. 卵形拟杆菌基因组中两个离散的多糖利用位点（PULs）被纤维二糖激活

设计分组葡萄糖和纤维二糖和BO分别共培养，然后提取BO的RNA，进行原核转录组测序（RNA-seq）。

结果显示在纤维二糖组中有19个基因显著上调，且该基因分布在两个离散的PUL，包括PUL1（BACOVA_20624-BACOVA_02638）和PUL2（BACOVE_02741-BACOVA_02745），这两个PUL通过RTqPCR进一步验证。PUL1由15个基因组成，包括一对SusC/SusD（转运蛋白/聚糖结合蛋白）、糖苷水解酶（GH5和GH2）。PUL2由五个基因组成，主要包括两个糖苷酶水解（GH16和GH3）。

4. 发现两种可降解纤维二糖的新型纤维素酶

为了确定哪种PUL介导纤维二糖的降解，纯化了每种PUL编码的重组蛋白，并制备了相应的多克隆抗体。结果显示，BACOVA_2626^GH5、BACOVA_02630^GH5、BACOVA_2631^GH2和BACOV-A_02745^GH3在纤维二糖存在下特异性表达。利用蛋白酶K去除细胞表面蛋白，BACOVE_2626^GH5，BACOVA_0630^GH5和BACOVA_02740^GH3均不能用蛋白质印迹法检测到。通过高效阴离子交换色谱检测，进一步验证BACOVA_2626^GH5、BACOVA_02630^GH5和BACOVA_02745^GH3可以将纤维二糖消化为葡萄糖。

5. BACOVA_02626^GH5 和BACOVA_02630^GH5结构预测显示与土壤细菌有同源性

上述三种酶中，BACOVA_02745^GH3在过去已有文章报告过，作为纤维二糖的降解酶活性比较弱，因此后续就另外两种展开研究。BACOVA_02626^GH5和BACOVA_0630^GH5的残基置信度分数高的纸箱结构分别用粉红色或蓝色展示。进一步预测BACOVA_02626^GH5和BACOVA_0630^GH5点位置和催化口袋。预测结果发现BACOVA_2626^GH5催化袋可结合Ser 276、Trp 54、Asn 153、Glu 154、Tyr 215、Glu 241、Cys 284、Glu 281；BACOVA_02630^GH5，催化袋可结合Glu 293、Tpr 324、Asn 180、Phe 126、Arg 85、Tyr 248、Phe 49组成。

6. 纤维素酶重塑低纤维饮食小鼠肠道微生物群的组成

为了探索纤维二糖对低纤维饮食小鼠肠道微生物群的影响，低纤饮食小鼠每隔一天用纤维二糖口服处理。我们观察到纤维二糖改善了体重减轻。基于LEfSe分析，比较两组属水平差异。结果发现，纤维二糖处理后，另枝菌属（Alistipes ）显著增加。

7. 细菌的代谢功能可能被改变，并可能有助于抑制炎症

MetaCyc数据库分析49差异异最大的代谢通路。这一结果表明，纤维二糖能特异性激活微生物组代谢通路。此外，通过Tax4Fun工具预测了与碳水化合物代谢相关的酶。与对照组相比，只有β-N-乙酰己糖苷酶、α-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶显示出差异。此外，通过PICRUSt1预测了KEGG通路。纤维二糖处理后，代谢相关的KEGG途径（包括组氨酸、甲烷、维生素B6和叶酸生物合成）显著富集。过去已有文献表明，β-N-乙酰己糖胺酶和组氨酸（由罗伊氏乳杆菌代谢为组胺）已被证明可抑制结肠炎症。因此，分析结肠组织中TNF-α和IL-6等促炎因子。我们发现纤维二糖处理后，TNF-α和IL-6的mRNA表达水平显著降低。由于组氨酸代谢途径显著富集，还分析了组胺H2受体（H2R）。结果显示，纤维二糖给药后，H2R的mRNA表达水平显著增加。此外，通过IHC进一步验证TNF-α和IL-6的蛋白质水平，结果表明纤维二糖处理后IL-6和TNF-α降低。综上结果，纤维二糖可以改变肠道微生物的代谢途径，但是这种改变对于肠道炎症的影响尚不明确还需要结合宿主本身的研究作为支持。