Xenium空间原位分析高端局——从文献解析到研究思路大揭秘

书接上文，已经给大家分享了Xenium空间原位分析的技术原理及特点，样本制备及应用方向，那如何利用这一硬核技术发表高分文章呢？今天小编就对Xenium技术首发的文献案例进行详细解析，并以此总结拓展相关的研究思路，期望能给到大家参考和启发。

今天要分享的是10x Genomics团队于2022年10月发表的首篇Xenium空间原位分析应用的bioRxiv预印本文章，文章标题：High resolution mapping of the breast cancer tumor microenvironment using integrated single cell, spatial and in situ analysis of FFPE tissue.

乳腺癌具有高度异质性，临床上通常根据受体类型(例如，HER2+/ER+/PR+)以及侵袭和增殖程度对乳腺癌进行肿瘤分型，但这种分类不足以描述样本中的异质性。导管原位癌（DCIS）是一种非浸润性乳腺癌，是局限在导管内的肿瘤上皮细胞，并没有扩散到导管的周围。当导管形态被破坏，癌细胞侵入间质时，DCIS可能进展成预后差的浸润性导管癌。哪些DCIS会成为浸润性乳腺癌，哪些不会？目前的研究尚不明确。

乳腺癌块来自乳腺癌患者(II-B期，ER+/PR−/HER2+)乳腺活检的FFPE样本，其中包括导管原位癌和浸润性导管癌。用FFPE样本的连续切片进行单细胞转录组测序（scFFPE）、空间转录组测序（Visium）和原位分析（Xenium）。这里使用Xum Human Breast Panel的280个基因和33个附加基因（共313个）作为靶基因，通过Xenium技术对这些靶基因进行亚细胞水平的空间原位检测。然后对三种技术检测到的数据进行比较与联合分析，进而高灵敏度，高特异性，高分辨率地解析了乳腺癌肿瘤的异质性。

1. scFFPE+Xenium联合高灵敏度解析乳腺癌组织中的细胞组成

首先对scFFPE-seq数据进行非监督聚类和细胞注释，鉴定到淋巴细胞、巨噬细胞、内皮细胞、DCIS1、DCIS2和侵袭性肿瘤细胞等17种细胞亚群。然后对Xenium数据进行分析，发现了与scFFPE-seq一致的细胞类群。此外，与scFFPE-seq相比，Xenium能够获得更多的细胞数量，因此细胞类群的密度要高很多。总之，该部分结果说明了Xenium技术能够解析复杂组织中的细胞组成。

接下来，作者使用scFFPE-seq数据确定Xenium数据中三个感兴趣区(ROI)：DCIS#1、DCIS#2和invasive  的细胞组成和比例的差异。结果发现ACTA2+肌上皮细胞在DCIS#2 ROI中富集，在DCIS#1 ROI中较少，在invasive ROI中缺失。而且DCIS#2 ROI比DCIS#1 ROI含有更多侵袭性肿瘤细胞，KRT15+肌上皮细胞也更多，提示DCIS#2 ROI比DCIS#1 ROI更具侵袭性。

最后，作者探究了七种主要细胞类型的marker基因在这三个区域的表达差异。结果发现，在DCIS#1 ROI中肿瘤细胞标记基因MZB1特异性高表达，DCIS#2 ROI显著高表达基质细胞的标记基因GJB2，invasive ROI中缺少巨噬细胞标记基因MMP12的表达。

2. Visium+Xenium联合挖掘感兴趣区域的完整转录组信息

在临床上，乳腺癌根据雌激素受体(ER/ESR1)、孕激素受体(PR/PGR)和人类表皮生长因子受体2(HER2/ERBB2)的表达进行亚型分类，并根据肿瘤分型结果制定治疗策略。该研究中使用的组织样本被注释为HER2+/ER+/PR−。Xenium数据显示组织切片的大部分区域同时表达ERBB2和ESR1转录本（HER2/ER双阳性），或只表达ERBB2转录本（HER2阳性）。然而，在脂肪细胞区域内有一个很小的DCIS区域，显示出ERBB2、ESR1和PGR转录本的三阳性表达（HER2+/ER+/PR+）。

在Visium数据中，这个区域只有5-6个spot，因为太少这个区域很容易被忽视。为了从这个三阳性区域获得完整的转录组信息，作者通过插值法可视化了这个三阳性区域内的细胞类型比例。然后对这6个spot与其它spot进行了全转录组差异表达分析，筛选到94个差异表达基因。

3. Xenium+H&E染色/免疫荧光染色

Xenium原位分析的另一个强大优势在于它的流程是非破坏性的，能够在运行后对同一组织切片进行H&E染色或免疫荧光染色。这一就能获得同一张组织切片的组织病理学、蛋白表达和基因表达数据，有助于更全面地了解样本的生物学特征。

该文章同时用scFFPE-seq、Visium和Xenium三种技术对一个乳腺癌FFPE 样本连续切片进行检测。作者首先是说明了三种技术的各自优势，尤其强调了Xenium技术的稳定性，高特异性，高灵敏度及高分辨率。然后三种数据联合分析，相互印证补充彼此的分析结果，展示出了三种技术的高度互补性。最终三种技术协同作用，共同解析了乳腺癌肿瘤微环境，揭示了细胞异质性，促进了对导管原位癌（DCIS）肿瘤浸润的全面研究。