干货连载：精确诱导型Cre-loxP系统实现特定时间基因启动

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接干货连载：决定目的基因特异性表达的关键技术——Cre-loxP

上期我们对Cre-loxP系统做了原理和应用的基础介绍，了解了这个系统适用的场景和范围以及如何获得转基因动物。以上都是依赖于Cre酶从而实现基因的敲低和过表达，要想实现特定时间的基因的启动需要更加精准的诱导型的Cre-lox系统。

更加精准的诱导型Cre-lox系统

1. CreER重组酶系统

CreER重组酶系统是由Cre重组酶和雌激素受体（estrogen receptor, ER）的激素结合域相融合组成。在没有雌激素类似物Tamoxifen的情况下，Cre酶、雌激素受体配体结合域和热休克蛋白绑定在一起，存在细胞质中。当存在Tamoxifen时，热休克蛋白被排挤掉，Cre酶和雌激素受体的结合体蛋白可以进入细胞核，Cre酶发挥作用。

图1：tamoxifen诱导的Cre-ER系统[1]

2. Cre;Tet系统：

四环素（Tetracycline,Tet）诱导系统是由E.coli大肠杆菌中Tn10转座子改造而来，可依赖四环素进行可逆地调控基因表达。

该系统在大肠杆菌中由四环素阻遏蛋白（Tet repressor, TetR）和Tet操纵子（Tet operator, TetO）组成：在缺乏四环素Tc以及其衍生物强力霉素Dox的情况下，TetR二聚体和TetO结合，阻断基因表达；当Tc或者Dox与TetR结合时，诱导TetR构象变化，导致其与TetO分离促进基因表达。

图2：Cre;Tet系统作用原理[2]

该系统有两种模式：Tet-on和Tet-off。

在Tet-on系统中，TetR被改成rtTA，在Dox存在时，可以和rtTA结合并激活，激活的rtTA与TRE序列结合诱导Cre的表达；在没有Dox情况下，失活的rtTA无法与负责调控Cre基因的TRE序列结合，则Cre不表达。

图3：Dox诱导的Cre;Tet-on系统[1]

在Tet-off系统中，在没有Dox情况下，激活的rtTA能够结合Cre基因的TRE序列，诱导Cre表达。在Dox给药之后，与Dox相互作用的Tta被灭活，不再与TRE结合，因此Cre表达受到抑制。

图4：Dox诱导的Cre;Tet-off系统[1] 

基于Cre-loxP系统的工具病毒方案

基于以上的缺点，现如今越来越多的科研工作者选择新的方式来构建条件性基因敲除小鼠，即病毒依赖的Cre-loxP重组系统，以局部注射的方式实现更强的区域特异性、更少的花费以及更短的实验周期。基于Cre-loxP系统的工具病毒方案具体为下图两种：

1. 将表达Cre的病毒注射入转基因获得Floxed小鼠

可以通过转基因技术获得条件性基因敲除小鼠Floxed小鼠，再通过构建广谱或者组织特异性的Cre载体病毒，从而实现全身或者组织特异性的基因敲除。

图5：给予条件floxed鼠注射Cre依赖表达载体实现细胞特异性过表达

2.将表达loxP的病毒注射入转基因获得Cre小鼠

首先获得条件Cre的小鼠，再将表达loxP位点的病毒注射入小鼠体内，实现基因的过表达或者干扰。常用的Cre依赖表达系统：DIO序列策略 & LSL序列策略。

图6：给予条件Cre鼠注射Cre依赖表达载体实现细胞特异性过表达

如下图：2019 年慕尼黑大学生物医学中心的研究人员在 Neuron 上发表研究成果，该研究中作者就基于已有的星形胶质细胞特异性表达 Cre 的小鼠，构建了 Cre 依赖表达的 AAV-FLEx-Ngn2/Nurr1，注射到小鼠脑内后在星形胶质细胞中特异性的过表达了 Ngn2 和 Nurr1。图A中目标序列如果换成shRNA序列则可以实现组织特异性目的基因的干扰。

图7：给予条件Cre鼠注射Cre依赖表达载体实现细胞特异性过表达[3]

根据以上的介绍，我们可以了解到：当我们有flox鼠或条件Cre鼠时，通过工具病毒载体就可以快速获得想要的基因调控小鼠，小鼠与对应的工具病毒总结如下表，老师们可以根据自己的需要进行工具病毒的选择：

小编总结

学习完Cre-loxP系统相关的知识，小编不禁感慨Cre酶和loxP位点的应用十分的巧妙。对于基因敲除鼠的培育让我们可以获得想要的基因型的老鼠，而在此基础上工具病毒的使用又极大的缩短了实验的时间，吉凯基因提供广泛的工具病毒，满足不同课题的设计需要，能够进一步缩短各位老师们的实验周期，感兴趣的老师们快来咨询吧！！!

【参考文献】

1.H, K., et al., - Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of. - Lab Anim Res. 2018 Dec;34(4):147-159. doi: 10.5625/lar.2018.34.4.147. Epub 2018, (- 1738-6055 (Print)): p. - 147-159.

2.NP, v.T., et al., - Kupffer cells and not liver sinusoidal endothelial cells prevent lentiviral. - Mol Ther. 2005 Jan;11(1):26-34. doi: 10.1016/j.ymthe.2004.09.012., (- 1525-0016 (Print)): p. - 26-34.

3.N, M., et al., - Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse. - Neuron. 2019 Sep 25;103(6):1086-1095.e5. doi: 10.1016/j.neuron.2019.08.009. Epub, (- 1097-4199 (Electronic)): p. - 1086-1095.e5.

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