再次助力
Science论文（IF=47.7）
BD Rhapsody揭示B细胞
癌变关键机制
在体液免疫中，生发中心B细胞（GC B）通过高频体细胞突变和克隆扩增进行不断循环的自然选择，筛选出高亲和力的B细胞受体。这一过程也严格依赖于B细胞从滤泡辅助性T细胞（TFH）中所接收到的阳性选择信号。
GC B细胞高频突变和克隆扩增会使B细胞癌变的几率大大增加。因此，免疫系统相关恶性肿瘤大部分都是由B细胞所引起的，最为常见的是弥散性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphomas，DLBCL）。根据转录谱的不同，DLBCL可以分为生发中心B细胞样（germinal center B-like）DLBCL和活化B细胞样（activated B-like）DLBCL两类。在这些类型中，临床上最为难治的是MCD/5型，这是活化B细胞样DLBCL的一类亚群。然而这些癌变相关表型的分子机制，目前仍未知晓。BTG1突变是生发中心B细胞淋巴瘤的特异性突变之一，可以在遗传水平定义一类BLBCLs亚群，且这一亚群临床结果较差，探索BTG1突变对于肿瘤发病机制探索有重要意义。
2023年1月19日，来自美国纽约Weill Cornell Medicine的Ari Melnick研究组在国际顶级期刊Science（IF=47.7）上在线发表题为BTG1 mutation yields supercompetitive B cells primed for malignant transformation的研究论文。该研究论文使用BD Rhapsody单细胞测序平台对BTG1突变和对照组的GC B细胞以及TFH细胞进行测序，并使用 BD Rhapsody Analysis Pipeline 1.4 Beta进行数据分析，解析了BTG1在GC中的监控作用，BTG1可以保持B细胞竞争的微妙平衡，确保只有少数被选中的B细胞能在这种竞争性的自然选择过程中存活下来，同时也通过防止MYC的不适当刺激来控制竞争。
单细胞测序相关平台与应用
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BD Rhapsody 单细胞多组学分析平台
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靶向转录组，BD Rhapsody mouse immune response panel
货号 633753
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BD Rhapsody Analysis Pipeline 1.4 Beta
实验结果
DLBCL中的BTG1体细胞突变
是遗传驱动因素
作者对包括DLBCL在内的一共25,670例癌症患者的基因组数据库进行了分析，结果发现BTG1在DLBCL中的体细胞突变达到11%，而在其他类型的癌症中却很少见到。而在DLBCL中，BTG1的突变主要富集在临床上难以治疗的ABC-DLBCL上，尤其是MCD/5淋巴瘤。作者利用多个基因组和表观基因组协变量进行了严格的遗传驱动分析，结果发现BTG1突变在DLBCL驱动因素中的得分十分靠前。这些结果说明BTG1在DLBCL中可能起到驱动的重要作用。BTG1的突变多发现在蛋白的N端几个保守功能结构域上，尤其是第36位的谷氨酰胺，最容易突变成组氨酸（Q36H）。因此作者构建了Q36H小鼠模型进行相关分析。
图1. DLBCL中BTG1错义突变的特征分析
BTG1Q36H突变会形成超竞争
的GC B细胞
作者构建了条件性表达BTG1Q36H的小鼠模型，与CD19 cre工具鼠交配之后，会在B细胞中产生特异性BTG1Q36H突变。随后，作者对B细胞进行了一系列表型分析。首先利用羊血清免疫小鼠后，检测脾脏的免疫应答。结果发现突变和野生型小鼠的GC响应没有差异。因此作者接下来进行了B细胞克隆选择性的优势分析。作者将BTG1Q36H突变小鼠与表达对hapten 4-hydroxy-3-nitrophenyl acetyl (NP)具有高亲和力B细胞受体的B1-8hi小鼠进行交配，随后将B1-8hi/Q36H和B1-8hi/CRE neg-control B细胞移植到WT小鼠中，结果发现Q36H GC B细胞会随着时间推移逐渐表现出竞争优势，在第14天的时候约90%的GC B细胞都是Q36H 突变的B细胞。而在T细胞非依赖的B细胞激活中，作者通过评估Q36H和CRE对照组B细胞的竞争性增殖发现，两者之间并无明显差异。这些结果说明，BTG1Q36H会导致GC B细胞有T细胞依赖的竞争优势。
图2. BTG1Q36H突变会形成超竞争的GC B细胞
Btg1Q36H诱导GC B细胞中
MYC相关的生物合成
为了探究竞争优势的机制，作者对Q36H和CRE对照组GC B细胞进行了RNA测序。结果发现两者之间的Btg1转录组丰度接近。Btg1大约有15%的转录本携带Q36H突变，与BTG1Q36H的DLBCL患者中的比例接近。利用基因集富集分析（GSEA），作者鉴定94个富集信号，包括生物合成，线粒体功能和MYC的靶基因。网络连接性分析发现MYC发挥重要的中心作用。在GC明区（LZ）中，在接受强烈的TFH细胞信号之后，Myc与mTORC1会暂时被激活，它们的生物合成会诱导GC B细胞的生长，为B细胞随后在GC暗区（DZ）中克隆扩增奠定基础。与之对应的是，作者在LZ到DZ的循环GC B细胞中检测到了TFH细胞的信号富集。此外，在DLBCL患者中也检测到了类似的信号富集。随着生物合成速率的提高，Btg1Q36H GC B和Btg1Q36H DLBCL细胞的RNA丰富增加，细胞体积变大。这些数据说明BTG1突变会导致阳性选择和Myc/mTORC1激活相关的生物合成增加。
为了确定Myc相关的信号通路富集是由于Myc表达上升还是Myc阳性（Myc+）GC B细胞比例增加引起，作者将Q36H小鼠与MycGFP小鼠交配，结果发现MycGFP+的GC B细胞数目在Q36H中明显增加，而两者细胞之间的RNA和蛋白水平无明显差异。转录组的数据发现差异基因主要富集在Myc早期作用的靶标基因上。因此，Btg1突变的GC B细胞与表达Myc细胞比例增加及早期Myc通路激活相关，而与细胞中Myc表达水平无关。
图3. Btg1Q36H诱导GC B细胞中myc相关的生物合成
Q36H突变导致BTG1与MYC和
其他参与LZ-to-DZ再循环的转录本
关联受损
作者接下来对BTG1Q36H如何影响MYC表达进行了探究，BTG1及其家族蛋白TOB1和TOB2的N端结构域保守，TOB1和TOB2最近被发现可以与RNA相互作用。因此作者对BTG1进行了RNA免疫沉淀（RIP）。结果发现BTG1WT可以富集到3000左右的mRNA种类，而BTG1Q36H只能富集到700左右的mRNA种类。其中显著减少的转录本包括MYC mRNA，还有很多富集在LZ-to-DZ回收以及MycGFP+信号上。在BTG1Q36H的DLBCL患者中也检测到类似的结果。这些数据表明，野生型的BTG1可以与MYC及GC B细胞中LZ-to-DZ循环相关的转录本相互作用，而N端突变的BTG1功能受损。
图4. Q36H突变破坏BTG1-MYC mRNA的关联并增强MYC蛋白合成动力学
BTG1Q36H降低了MYC蛋白
合成的阈值
作者接下来探究了BTG1突变细胞中MYC mRNA是否与蛋白产生动力学可能产生的改变相关。首先作者检测了myc mRNA在细胞内的稳定性，结果发现BTG1Q36H和BTG1WT组没有显著差异。接下来使用Western blots检测了蛋白表达动力学，结果发现BTG1Q36H组的蛋白水平比BTG1WT组明显升高。随后作者利用FACS检测了单个细胞中MYC的表达水平，结果发现MYC+细胞中MYC蛋白会有轻微上调并且表达速度更快。
为了直接检测MYC mRNA参与翻译调控，作者对BTG1Q36H和BTG1WT DLBCL细胞进行多聚核糖体分析，结果发现突变组的核糖体比例有更高的富集，暗示了整体翻译的增加。这些数据表明，野生型BTG1和MYC mRNA的相互作用可能会限制MYC蛋白翻译，而BTG1突变会导致GC B细胞响应MYC诱导的滤泡辅助性T细胞依赖的信号阈值降低，因此增强GC B细胞对TFH细胞信号的应答。
BTG1Q36H的LZ-to-DZ循环
细胞可以更快地完成S期
TFH细胞信号及Myc的诱导会决定GC B细胞通过S期，进入暗区进行增殖的速度和能力。因此，作者对BTG1突变导致myc动力学增加，从而导致GC B细胞尽快通过S期进行复制进行了验证。作者利用BD Rhapsody单细胞测序平台对实验组B1-8hi/Btg1Q36H 和对照组B1-8hi/CREneg的GC B细胞进行单细胞测序，总共检测了2982个单细胞，并根据转录组特征和marker将这些细胞分为DZ，LZ和LZ-to-DZ循环的亚细胞群。
为了比较Q36H和对照组GC B细胞的细胞周期进程，作者根据细胞周期通路的表达，从G1期开始进行了拟时序分析。结果发现BTG1Q36H中从S期起始到G2/M阶段的细胞密度显著增加。和预期一致，表达LZ-to-DZ循环通路的细胞主要富集在G1到S过渡，并延伸到G2/M阶段。而LZ-to-DZ的GC B细胞中，BTG1Q36H细胞比例更多，出现得更早。因此，BTG1Q36H的LZ-to-DZ循环的GC B细胞会导致暗区增殖更早，比例更高。
为了确定Btg1突变的GCB细胞能否更快完成S期，作者在竞争实验中检测了细胞周期动力学。通过EdU和BrdU检测细胞增殖的速度，结果发现BTG1Q36H GC B细胞的确可以更快地进入并完成S期。
图5. BTG1Q36H的LZ-to-DZ循环细胞可以更快地完成S期
BTG1Q36H的竞争优势与
LZ-DZ动力学加快相关
作者接下来通过计算机模拟GC空间的不同角度和克隆选择动态变化，通过不同的参数和条件设置，作者预测Btg1突变的GC B细胞在GC反应过程中会经历更多轮突变和选择。为了验证这个观点，作者检测了体内Q36H和WT GC B细胞的同步竞争情况，比较了两者之间的LZ-to-DZ动力学。作者将Q36H和WT B细胞等量移植到GC中，通过同源和荧光标记区分不同来源的细胞。通过注射结合B细胞表面受体DEC205的OVA偶联抗体可以诱导TFH细胞信号，然后作者对不同时间点LZ和DZ区域的GC细胞比例进行了检测。与之前的报道一致，DEC205-/-细胞一直富集在LZ区域，而CD205+/+细胞在48小时和72小时开始转移到DZ区域扩增。在Q36H GC B细胞中，TFH细胞信号可以诱导DEC205+/+细胞产生更强的DZ:LZ比例。这些数据表明，TFH细胞诱导相关的Myc表达和S期的加速完成会导致GC B细胞有一个逐渐和显著的竞争优势，其机制可能是由于进入DZ区域的细胞比例及GC重复轮数增加导致。
图6. BTG1Q36H的竞争优势与LZ-DZ动力学加快相关
BTG1Q36H表达会诱导高度
侵袭性的淋巴瘤
接下来，作者研究了BTG1突变是否会引起淋巴瘤的发生。临床上的MCD/5 DLBCLs通常会高表达BCL2。因此作者将Q36H突变小鼠与Bcl2高表达小鼠模型进行交配，并展开了一系列研究。组织学观察发现，Bcl2脾脏滤泡突出，其他结构基本正常，而Bcl2+Q36H的B细胞滤泡和GC区域发生明显的扭曲和扩张，并且GC B细胞占B细胞比例增加，体积变大，更易克隆增殖。此外，Bcl2+Q36H的淋巴结结构严重破坏，滤泡外区域扩张，包含增生和增殖的淋巴瘤细胞。最值得注意的是，Bcl2+Q36H小鼠显示出恶性B细胞浸润到结外组织，如肝、肾和肺，而Bcl2小鼠在这些组织中只表现出轻微的血管周围浸润表型。通过BCR测序发现，Bcl2+Q36H淋巴瘤B细胞的突变和克隆扩增的比例上升，经历了更多轮的选择和体细胞超频突变，这与他们的适应性竞争优势是一致的。
进一步发现濒死的Bcl2小鼠表现为低级别的滤泡中心细胞样淋巴瘤，而濒死的Bcl2+Q36H小鼠表现为更大的淋巴样细胞，与DLBCL中许多免疫母细胞或浆细胞样外观类似。并且这些差异特征在脾脏和结外组织中也被观察到。
与这些侵袭性表型相一致的是，作者发现ABC-DLBCL中BTG1突变患者的临床结果不佳，总生存率较低。这些数据表明BTG1突变具有很强的致癌效果，其突变会使GC B细胞具有超竞争适应性，赋予B细胞淋巴瘤侵袭性和组织侵袭性表型，导致结外扩散和较差的临床效果。
图7. BTG1突变会驱动小鼠和人类中高侵袭性B细胞淋巴瘤的形成
总结与展望
DLBCL是最常见的非霍奇金淋巴瘤类型，至少有40%的病例对治疗没有反应，而携带BTG1基因突变的B细胞淋巴瘤中患者往往具有较差的治疗效果和预后。但BTG1在B细胞淋巴瘤中的分子机制尚不明确。在这项研究中，作者利用BD Rhapsody单细胞平台解析了BTG1在DLBCL中的作用，发现BTG1可以通过控制B细胞中MYC蛋白的表达速率，防止MYC的不适当刺激来控制B细胞竞争，实现GC B中微妙的平衡。这些结果为DLBCL淋巴瘤患者的治疗提供了理论基础和相关靶点。
单细胞多组学平台
BD Rhapsody™
BD Rhapsody™ 单细胞多组学分析系统能够对成千上万个单细胞的蛋白与基因进行数字定量，提供灵活的定制化Panel及标准化应用方案，以满足不同的实验需求，其独特的混样技术可有效节约时间与成本。
系统组成包括：
BD Rhapsody™ 扫描仪
BD Rhapsody™ 上样台
BD Rhapsody™ cartridge（微孔板）
分子标签试剂和文库制备
全转录组检测试剂盒/靶向RNA检测试剂盒/定制试剂盒
Abseq蛋白检测试剂盒
多样本混样检测试剂盒
VDJ检测试剂盒
单细胞测序数据分析软件BD SeqGeq
1.实验技术干货
2.蛋白质组学研究
3.腺病毒简介及应用
4.临床基础研究思路解析
5.组织特异性腺相关病毒
6.单细胞测序
7.慢病毒实验操作指南
8.悬浮细胞专用病毒
9.靶点设计/数据库教程
10.测序技术研究与应用
11.非编码RNA研究技术与应用
12.腺相关病毒选择/应用
13.表观遗传研究
14.文章解析
15.国自然课题设计思路解析
16.生物信息分析及工具
17.外泌体研究
18.肿瘤免疫研究
19.高分文章
20.吉凯病毒神经方向应用案例