项目文章|武汉协和医院胸外科廖永德团队揭示METTL3新型小分子抑制剂在NSCLC中的抑癌效应及其翻译组学特征

全球范围内，肺癌的死亡率居肿瘤首位，发病率也稳居第二。其中占肺癌80-85%的非小细胞肺癌（NSCLC）被公认为具有遗传和细胞异质性特征。这种异质性为耐药提供了沃土，极大影响了临床疗效。在最近十年中，PD-1/PD-L1抗体使得一部分NSCLC患者生存获益，然而，由于受体抗原的表达受限，免疫疗法的活性有限，NSCLC患者的5年总生存率仍低于20%。

靶向翻译调控机制的组成部分有望克服疾病异质性^[1]，有研究揭示了METTL3介导的mRNA环化能够促进翻译过程加速肿瘤的发生发展^[2]。越来越多的证据表明，METTL3在NSCLC中显著过表达并促进其进展，但其潜在机制尚不清楚。此外，膀胱癌等多种肿瘤研究已经报道了METTL3能够调控PD-L1表达^[3]。因此，METTL3可能是NSCLC治疗的新靶点，STM2457作为首个生物可利用的METTL3小分子抑制剂，可能是显著抑制肿瘤进展、克服异质性并扩大免疫治疗获益的NSCLC治疗新策略。

STM2457于2021年4月由Yankova等人合成并证实其在急性髓系白血病中有显著治疗效果^[4]，其在肝内胆管癌等实体肿瘤中的抑癌作用近年来也陆续得到关注^[5]。2023年4月13日，华中科技大学同济医学院附属协和医院胸外科廖永德团队在Journal of Pharmaceutical Analysis（IF=14.026）上发表题为Effects and translatomics characteristics of a small - molecule inhibitor of METTL3 against non-small cell lung cancer的研究。该研究率先在NSCLC中评估了STM2457体内外抑癌效应，探究了其对靶点METTL3的影响，揭示了其作用下的多种组学（尤其是翻译组学）特征，并探讨了其对PD-L1的调控，为后续挖掘STM2457在NSCLC中的治疗潜能奠定了基础。

鉴于STM2457作为METTL3新型小分子抑制剂首次应用于NSCLC，我们初步明确了体外处理NSCLC细胞系的最适浓度（5 μM）和最佳时间（6 days）。围绕上述浓度和时间，我们设置了药物处理的浓度梯度和时间梯度，基于NSCLC细胞系和正常肺上皮细胞系在STM2457处理下的量效反应曲线计算了该药物对不同细胞系的半数抑制浓度（IC₅₀），结果表明，相比于正常细胞，NSCLC细胞系具有更小的IC₅₀，对STM2457更敏感。包含克隆形成实验、划痕实验、侵袭性Transwell实验、基于Annexin V-FITC/PI的FACS分析及凋亡蛋白western-blot等一系列体外效应学实验结果表明，STM2457能够阻滞NSCLC增殖、抑制侵袭转移并促进凋亡。随后初步从肺转移小鼠模型中获得的数据也支持，STM2457能够有效地抑制NSCLC在体内定植和进展，有望成为NSCLC治疗的新策略。

(1) 在NSCLC综合评估STM2457对METTL3的作用

为了揭示上述抑癌效应的潜在分子机制，作为STM2457靶点的METTL3，其蛋白表达和酶活性的变化是我们首先需要明确的。有趣的是，STM2457作为METTL3的抑制剂被合成出来，在NSCLC中却能够显著上调METTL3的蛋白表达，其上调效应具有时间依赖性和浓度依赖性特征。尽管这种代偿性上调靶点表达的现象在小分子抑制剂中并不少见，但无疑意味着STM2457对METTL3调控具有复杂性，临床转化存在挑战。随后我们量化并对比了STM2457处理前后全RNA水平上m⁶A修饰水平，以反映METTL3介导m⁶A修饰的酶活性变化，该结果证实了我们的担心。随着STM2457处理时间的延长或浓度的递增，METTL3介导的m⁶A甲基化修饰活性出现了先抑制后激活的现象，抑制效应在第3~4天或5μM浓度时最为显著。结合量效曲线的结果，我们不难发现，STM2457抑制m⁶A甲基化最显著的时间点（第3~4天）要早于抑制增殖的时间（第6天），诚然这类表观治疗的效果普遍弱于致癌驱动基因抑制剂的疗效，但抑制增殖的效应是否不完全依赖METTL3介导的m⁶A甲基化，还有待进一步探究。

据此，我们认为STM2457的效应主要是其抑制METTL3酶活性同时上调其蛋白表达的综合的结果。在低浓度或短时间内，STM2457介导的METTL3酶活性抑制占主导，超过了一定的浓度或时间节点，STM2457作用的天平则倒向了上调METTL3蛋白表达一方。总之，无论METTL3是否失活，STM2457显著上调了其总体表达。换言之，STM2457也可以视为METTL3一种新型的“上调剂”。

(2) 在NSCLC揭示STM2457对多种组学（尤其是翻译组学）特征的影响

METTL3能够与翻译起始复合体互作，以一种不依赖酶活性的形式促进翻译^[6]。基于上述STM2457对于靶点METTL3的综合影响，我们认为作为一种“上调剂”的STM2457可能对于翻译调控的影响更为重要且纯粹。结合Ribo-seq和RNA-seq数据，STM2457处理A549后翻译效率变化超过2倍的5208个差异基因被筛选出来了，在3871个翻译效率显著上调的基因，我们发现STM2457直接作用靶点METTL3和NSCLC免疫治疗的重要靶点PD-L1赫然在列。在STM2457处理下，PD-L1的翻译效率从处理前的0.01提高到了处理后的1.21，而METTL3的翻译效率也提高了2.1957倍，后者也许是STM2457上调METTL3表达的潜在机制之一。

已经发表的HeLa细胞中METTL3删失前后ribosome profiling数据则为我们提供了新的视角去进一步理解STM2457对翻译组学特征的影响。几乎所有差异翻译基因（4286/4383）的翻译效率均下调，提示METTL3删失对翻译调控的主要作用是诱导其抑制。尽管细胞系不同可能会影响分析结果，但我们还是将STM2457处理后A549和METTL3删失后HeLa翻译组学数据联合起来进行了初步的分析，结果提示存在一个包含有659个差异基因的子集，该子集中的所有基因其翻译效率的变化与METTL3表达的变化呈正相关，而PD-L1和METTL3则在其中。即是说与STM2457处理相一致，METTL3删失能够导致PD-L1翻译效率从3.58降至1.19，而METTL3的翻译效率则降低5.74倍。因此，我们推测该基因集的翻译调控可能更依赖于METTL3的表达而不是其催化活性。

诚然，要完全揭示STM2457在NSCLC中的作用机制还有很长的路要走。然而，基于目前的证据，我们可以初步构建STM2457调控PD-L1翻译的模型。无论失活与否，METTL3总蛋白表达在STM2457作用下上调了，能够以一种非酶活性依赖的形式与翻译起始复合体互作环化更多的mRNA，随后更多的核糖体被募集到环化的PD-L1的mRNA上提高了其翻译效率上调了其表达。

为了系统地验证STM2457对PD-L1的调控作用，我们利用western blot检测了PD-L1在NSCLC细胞中的总表达，使用流式细胞术评估了其在膜上的表达水平，此外我们还关注了IFN-γ诱导有否影响STM2457调控PD-L1。结果一致表明，无论是总表达还是膜表达，无论是否存在IFN-γ的诱导，STM2457均能上调PD-L1的表达。为了进一步明确METTL3酶活性在上述调控作用中的影响，我们分别进行了野生型METTL3敲除、过表达野生型METTL3或过表达酶缺失型METTL3处理。有趣的是，无论过表达野生型METTL3还是酶缺失型METTL3均能够有效地上调PD-L1的表达，提示METTL3的酶活性在调控PD-L1表达中并不是必要因素。

基于对NSCLC进展的抑制作用，STM2457有望成为一种新的肿瘤抑制剂；基于对翻译组学特征的影响，STM2457具有克服肿瘤异质性的潜能；基于对PD-L1表达的上调，STM2457有潜力改善免疫治疗的疗效。然而，STM2457抑制NSCLC进展的体内证据和多组学机制还需要进一步探究。此外，STM2457克服异质性的潜能还停留在理论阶段，相关机制的研究将是我们下一步的重点。

依托于该研究成果，相关的发明专利《STM2457的新用途》（发明人为肖晗、廖永德）于2023年3月获得国家知识产权局正式授权。

在这项研究中，研究人员结合Ribo-seq和RNA-seq技术（吉凯基因提供）对STM2457处理下NSCLC细胞的翻译组学特征进行了系统性描述，筛选出包含METTL3和PD-L1在内5000余个差异翻译基因，为揭示METTL3新型小分子抑制剂的作用机制提供了全局性数据支持，有力地推动了靶向METTL3介导的翻译调控的基础研究与临床转化。

本研究第一作者为华中科技大学同济医学院附属协和医院胸外科肖晗博士后，通讯作者为华中科技大学同济医学院附属协和医院胸外科廖永德教授和肖晗博士后，其他合著者为华中科技大学同济医学院附属协和医院胸外科赵荣博士和上海交通大学医学院附属瑞金医院胸外科孟汪洋博士后。

【参考文献】

[1] Bhat M, Robichaud N, Hulea L, et al. Targeting the translation machinery in cancer[J]. Nat Rev Drug Discov. 2015, 14(4): 261-278.

[2] Choe J, Lin S, Zhang W, et al. mRNA circularization by METTL3-eIF3h enhances translation and promotes oncogenesis[J]. Nature. 2018, 561(7724): 556-560.

[3] Chen H, Pan Y, Zhou Q, et al. METTL3 Inhibits Antitumor Immunity by Targeting m(6)A-BHLHE41-CXCL1/CXCR2 Axis to  Promote Colorectal Cancer[J]. Gastroenterology. 2022, 163(4): 891-907.

[4] Yankova E, Blackaby W, Albertella M, et al. Small-molecule inhibition of METTL3 as a strategy against myeloid leukaemia[J]. Nature. 2021, 593(7860): 597-601.

[5] Xu Q C, Tien Y C, Shi Y H, et al. METTL3 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression by regulating IFIT2  expression in an m(6)A-YTHDF2-dependent manner[J]. Oncogene. 2022, 41(11): 1622-1633.

[6] Lin S, Choe J, Du P, et al. The m(6)A Methyltransferase METTL3 Promotes Translation in Human Cancer Cells[J]. Mol Cell. 2016, 62(3): 335-345.