生信分析带你打入免疫军团内部

人体的免疫系统由数十亿细胞组成，俨然一支庞大的士兵军团，每个战士分工明确，共同担任着守卫人体的任务。因此，探究机体内每个细胞发挥功能的免疫机制显得尤为重要。然而，常规的免疫组库方法无法确定哪些细胞在执行哪些任务，只能勾画一个宏观的景象。这时，单细胞免疫组库测序的出现可以帮助我们打入免疫军团内部，在单细胞层面研究免疫机制，获得基本的免疫组库信息，挖掘免疫组库和疾病之间的联系，为守护人类健康添砖加瓦。

免疫组库是指机体内T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）多样性的集合，可以全面地反映机体免疫系统在特定时间段内应对外界刺激应答的能力，可以用于表征机体免疫系统的健康状况。而单细胞免疫组库测序就以T/B淋巴细胞为研究目标，以富集扩增决定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）多样性的互补决定区（CDR区），再结合高通量测序技术，全面评估免疫系统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的关系。

接下来，小编就带大家学习两篇运用免疫组库分析的文献，着重挖掘免疫组库测序分析在文章中是怎么运用的，看看生信分析如何打入免疫军团内部！

由SARS-CoV-2驱动的2019冠状病毒病(COVID-19)是一种已成为全球健康威胁的严重传染病。疫苗是抗击COVID-19最有效的公共卫生工具之一。免疫状态是评价疫苗安全性和免疫应答的关键，然而，对免疫应答过程中的免疫应答演化仍知之甚少。单细胞RNA测序(scRNA-seq)是解剖多细胞行为和发现治疗性抗体的有力工具。通过在免疫期间对4名COVID-19疫苗试验参与者的外周血单核细胞进行scRNA/V(D)J-seq来表征疫苗试验参与者不同时间点不同剂量的免疫状况，作者发现一致的细胞类型特异性IFN反应（干扰素调节免疫反应）增强了细胞免疫，SARS-CoV-2特异性抗体增强了体液免疫；基于CDR3序列和生殖系富集，识别到几种潜在的结合抗体。

四名COVID-19疫苗试验参与者的外周血单核细胞（PBMC）

作者对一共4名参与者接种了Ad5-nCoV疫苗，其中两名参与者(P1和P2)接受了中剂量的肌肉注射疫苗，而另外两名参与者(P3和P4)接受了高剂量注射。然后对4名参与者在接种疫苗前和接种后第14天和第28天的外周血单核细胞进行单细胞RNA测序和VDJ测序，观察细胞免疫和体液免疫反应的动态，以评估该疫苗在单细胞分辨率下的有效性，构建了免疫细胞图谱 （图1）。

图1.工作流程

通过将B细胞的基因表达数据投影到t-SNE图中，作者确定了4个B细胞群，即naïve B细胞，记忆B细胞，浆细胞和衰老B细胞。因为B细胞的比例在不同时间点没有明显的变化，作者使用单细胞BCR测序(scBCR-seq)来评估克隆BCR扩增状态 (图2b）。根据时间点，作者发现每个参与者在不同的时间点表现出不同的克隆模式。接种疫苗第14天的P4有显著性扩展克隆（图2c）。在个体水平上，与其他参与者相比，P3经历了显著的BCR亚型转变 (图2d)。scBCR-seq揭示B细胞和BCR亚型的不同反应表明个体对疫苗接种的差异，支持B细胞在受试者接受高剂量免疫时优先经历独特的V(D)J克隆重排的假设。

图2

(a)所有参与者和时间点的B细胞亚型的t-SNE分群。

(b)B细胞亚型在不同参与者和时间点上的比例。

(c)饼状图显示了跨时间点的BCR克隆差异。克隆型的复杂性和分布在不同样品间存在差异

(d)柱状图显示了每个参与者和时间点的每个同型的相对百分比。

作者确定了8个T细胞亚群，即naïve CD4+ T细胞、中央记忆CD4+ T细胞(CD4+ tcm)、效应记忆CD4+ T细胞(CD4+ Tems)、调节性T细胞(CD4+ treg)、naive CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞(CD8+ tcm)、细胞毒性CD8+淋巴细胞(CD8+ ctl)和增殖T细胞（图3）。

图3.所有参与者和时间点的NK和T细胞亚型的t-SNE分群

作者接下来评估免疫对T细胞分布的影响。可以观察到在所有T细胞亚型中，克隆扩增主要集中在CD8+ ctl上 (图4a, b)。之后采用单细胞TCR测序来评估不同时间点的TCR克隆扩增情况。作者发现在接种后第14天的TCR在寡克隆型中显示出轻微的萎缩。值得注意的是，在接种后第28天，克隆性变化似乎不明显（图4c）。鉴于T细胞应答的激活与某些上调的信号有关，作者在CD8阳性T细胞中观察到T细胞激活基因包括CD69、GZMA、GZMB和GNLY。参与者在第14天表达了大多数T细胞激活信号，进一步证实了临床试验的观察结果 （图4d）。总之，这些证明接种疫苗后第14天，T细胞激活进行了免疫应答。免疫激活特定的T细胞亚型，他们共同作用介导细胞免疫反应。

图4

(a) t-SNE显示在总T细胞中扩增的TCR克隆

(b) 不同T细胞亚型中扩展TCR克隆的数量

(c) 饼图显示了不同时间点和个体之间的TCR克隆差异
(d) 跨越每个参与者和时间点的T细胞激活信号z得分平均表达的热图。上面是所有患者中每个基因总表达的条形图。T细胞激活信号的表达在个体间表现出差异性。

川崎病(KD)是发达国家儿童获得性心脏病的最常见病因。尽管已经报道了免疫细胞的功能和表型变化，但对急性KD免疫反应的全部认识尚不清楚。作者对静脉注射免疫球蛋白（IVIG）治疗前后的7名急性KD患者和3名年龄匹配的健康对照者的外周血单核细胞进行了单细胞测序分析。该研究旨在确定KD患者中每种细胞类型变化的潜在生物过程，构建先天性和适应性免疫反应的单细胞景观。表达差异最显著的基因在单核细胞中被发现，在急性KD中促炎介质、免疫球蛋白受体高表达，MHC II类基因低表达。来自另外16名KD患者的细胞的单细胞RNA测序和流式细胞术分析显示，尽管治疗后总B细胞的百分比大幅下降，但B细胞中的浆细胞的百分比显著增加。与健康对照组相比，急性KD患者CD8+ T细胞比例明显降低，其中效应记忆CD8+ T细胞比例明显降低。治疗后观察到B细胞受体和T细胞受体寡克隆扩增。

在静脉注射免疫球蛋白（IVIG）治疗前后的7名急性KD患者和3名年龄匹配的健康对照者的外周血单核细胞

研究人员进行单细胞RNA测序确定了四个不同的B细胞亚群---naïve B细胞、记忆B细胞、介于naïve和记忆B细胞之间的细胞以及浆细胞。可以观察到治疗后总B细胞的百分比大幅下降 (图5)。

图5.主要细胞类型分群图

免疫球蛋白治疗后，浆细胞占总B细胞的比例较治疗前有所增加（图6a）。由于浆细胞是终末分化和分泌抗体的B细胞，这在以前的任何研究中都没有研究过，作者对另外16名KD患者和20名健康对照者进行了亚群的流式细胞术分析，也证实了治疗后患者的浆细胞比例明显高于治疗前和健康对照组 (图6b)。作者又分析了scBCR-seq数据来探究急性KD患者BCR库的动态变化。IVIG治疗后，IGHA和IGHG的百分比明显升高(图6c)。这表明免疫球蛋白从IgM/IgD到IgG/IgA的同型转换是由B细胞激活引起的。然后，作者根据每个患者独特的VDJ序列检查了BCR的克隆性。值得注意的是，在除P7之外的大多数患者中，与治疗前相比，治疗后克隆型BCRs的百分比显著增加, 并且可以观察到显著的寡克隆扩增，以IgA和IgG同型为主（图6d）。

图6.B细胞和BCRs特性

(a) scRNA-seq在不同条件下恢复的浆细胞百分比(KD患者n=7，健康对照组n=3)。

(b)流式细胞术验证浆细胞百分比，治疗后百分比下降的患者用红色表示，治疗后百分比上升的患者用蓝色表示。健康对照用绿色表示。

(c) scBCR-seq恢复的不同情况下BCR中IGHA和IGHG的百分比

(d)每个患者和健康对照者的BCR克隆型跟踪

接下来，作者完善了CD4+T、CD8+T细胞集群的鉴定。鉴定出Naïve CD4+T细胞，中心记忆CD4+T细胞，效应性记忆CD4+T细胞，调节性CD4+T细胞，Naïve CD8+T细胞，中心记忆 CD8+T细胞，效应性记忆CD8+T细胞，γδ T细胞和增殖型T细胞（图5）。与健康对照组相比，作者发现川崎病患者的CD8阳性细胞减少，KD患者的naïve CD8阳性T细胞在CD8阳性细胞中的百分比增加，效应记忆细胞在CD8阳性T细胞中的百分比降低（图7a, b）。这些结果表明效应记忆细胞在激活后迅速获得细胞毒性功能，是促成CD8阳性T细胞减少的主要亚群。对另外16名KD患者的CD8+T细胞亚群进行流式细胞分析，证实了与健康对照组相比，KD患者存在高比例的naïve细胞和低比例的效应记忆细胞，并且没有受到IVIG治疗的明显影响（图7c）。最后，作者根据单细胞TCR测序数据追踪了TCR克隆型。与BCR复合物的动态变化相似，作者观察到治疗后，大多数患者克隆型TCR的比例明显增加 （图7d）。

以上结果都支持假设：KD可能是由对特定常规抗原的获得性免疫反应引起的，而不是超级抗原。

图7.T细胞和TCRs特性

(a) scRNA-seq显示的PBMC中CD8阳性T细胞的百分比。

(b) scRNA-seq在不同条件下恢复的naïve和效应记忆CD8+ T细胞的百分比(KD患者n=7，健康对照组n=3)。

(c) 流式细胞术验证naive细胞和效应记忆T细胞的百分比。

(d) 每名患者和健康对照者的TCR克隆型追踪。

除了以上文献里分享的免疫组库测序分析在评估药物或疫苗功效方面的运用，免疫组库测序分析还有其他方面的应用，比如检测感染类疾病过程中的免疫动态变化，指导自身免疫性疾病治疗，预测器官移植的排斥反应等。感兴趣的老师可以多多探索免疫组库测序在这些方面的应用，也可以联系当地科研顾问咨询免疫组库测序分析方案设计。

【参考文献】

[1] Cao, Q., Wu, S., Xiao, C., Chen, S., Chi, X., Cui, X., Tang, H., Su, W., Zheng, Y., Zhong, J., Li, Z., Li, F., Chen, H., Hou, L., Wang, H., & Wen, W. (2021). Integrated single-cell analysis revealed immune dynamics during Ad5-nCoV immunization. Cell discovery, 7(1), 64. 

[2] Wang, Z., Xie, L., Ding, G., Song, S., Chen, L., Li, G., Xia, M., Han, D., Zheng, Y., Liu, J., Xiao, T., Zhang, H., Huang, Y., Li, Y., & Huang, M. (2021). Single-cell RNA sequencing of peripheral blood mononuclear cells from acute Kawasaki disease patients. Nature communications, 12(1), 5444.