small RNA 测序 
 

    Small RNA是生物体内一类重要的调控分子，参与细胞生长、发育、代谢、基因转录和翻译等诸多生物学过程，在疾病的发生发展转归的病理过程中也具有非常重要的作用，是一类新的极具开发潜质的生物标志物和药物靶标。新一代测序技术的高通量、高灵敏性、高精确性、低样品需求量、操作简便等特点，为在基因组范围内快速研究任一物种已知的small RNA的表达情况和预测挖掘新的small RNA调控分子提供了强有力的技术工具。本公司在多年miRNA表达谱芯片服务的基础上，推出基于Illumina GAIIx 的small RNA测序服务，结合illumina新推出的TruSeq样品制备、簇生成和测序试剂以及升级更新的算法软件，降低了测序过程中的GC偏向性，提高了测序覆盖度和均一性，测序数据更加准确、可靠。

一、实验流程



二、技术优势
·         高度开放性：无需预先了解序列信息和二级结构，即可研究任一物种已知的小RNA分子和预测新的小RNA分子。
·         高度灵活性：可研究任一17～35nt之间小RNA分子。
·         高度精确性：可精确到单核苷酸水平，非常有利于区分高度同源的小RNA分子和鉴定小RNA的多态性。
·         检测动力学范围广：可在超过6个数量级范围内实现准确的序列检测和定量分析，有利于低丰度小RNA差异表达的研究。
·         保持链特异性信息：保留了小RNA的原始链定位信息，有利于研究小RNA的表达调控机理。
·         数据质量高：深度测序保证了抽样随机性，可靠性和重复性高，与实时定量PCR结果具有较高的一致性。

三、数据分析
·         原始数据产出统计
·         已知 small RNA注释：miRNA, siRNA, piRNA, rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, repeat asscociated sRNA等
·         降解片段鉴定：mRNA, exon, intron等
·         预测新的 miRNA
·         miRNA同源性结构分析
·         miRNA表达谱聚类分析
·         miRNA差异表达分析
·         miRNA靶基因预测
·         靶基因功能注释、 Pathway和Gene Onlotogy富集分析
·         与mRNA进行关联分析（需要有mRNA数据）
 
四、样品要求
·         样品类型：细胞、新鲜组织或RNA样品。
·         样品量：细胞样品请提供至少5×106个细胞，组织样品请提供至少100mg的组织块或切片，RNA样品请提供10μg以上的总RNA。
·         样品质量：RNA无明显降解，提取的总RNA OD260/280值在1.8～2.2之间，浓度 ≥ 500ng/μl，28S:18S ≥ 1.5，RIN ≥ 8。
·         样品保存：细胞样品或新鲜组织块（切成～50mg的小块）可用TRIZOL或RNA保护剂处理或液氮冻存后，-80℃保存。RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存。样品保存期间避免反复冻融。
·         样品运输：样品置于1.5 ml管中，封口膜封好，干冰运输。
 

案例：通过深度测序分析乳腺癌中microRNA的序列和表达

 
背景： microRNAs调控很多对肿瘤发生非常重要的基因。乳腺癌中很多microRNAs是下调的，但系统的乳腺癌中microRNA的表达分析还没有被报道。
 
目的： 利用Illumina HiSeq2000测序平台对不同类型乳腺癌组织和细胞进行测序，分析其microRNAs表达差异。
 
结果：通过对11个正常乳腺组织，17个非转移组织，151个转移组织，及6种乳腺癌相关细胞系测序分析发现，正常组织中miR-21是高表达的，发生转移的乳腺癌病人的乳腺组织中mir-423是上调的，三阴乳腺癌病人中mir~17-92是特异性上调的，但是这些变化并不显著。这些结果表明，基于microRNAs水平对乳腺癌类型进行区分及预测转移统计学上可能是可行的，但是乳腺癌类型及转移的差异并不是由于富集的microRNAs的下调驱动的，提示在乳腺癌的发展过程中起作用的microRNAs不多。
 
原文索引：
Farazi TA1, Horlings HM, Ten Hoeve JJ（2011）MicroRNA sequence and expression analysis in breast tumors by deep sequencing. Cancer research, 71(13), 4443-4453

图1: 病人样品的microRNAs的聚类分析

图2：microRNAs与mRNAs的聚类分析的比较
 
 

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