SNP检测服务(SNaPsot、Taqman探针、HRM等)

 SNP分析检测

一、SNP定义
基因分型，也就是单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)检测，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。与其它分子标记相比，SNP分辨率最高也最为丰富，覆盖基因组范围大，遗传上比较稳定，在人类基因组中，估计平均每1000个碱基对就有1个SNP，估计其总数可达300万个甚至更多，是继微卫星之后的第三代遗传标记。SNP的分布不均匀，非转录序列中要多于转录序列，绝大多数位于蛋白的非编码区。通常情况下是一种二等位基因的变异，多为转换，即一种嘧啶碱基换为另一种嘧啶碱基，或一种嘌呤碱基换为另一种嘌呤碱基，转换与颠换之比为2：1。SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C→T，因为CG中C即胞嘧啶常为甲基化的，自发脱氨后即变为胸腺嘧啶。
二、SNP主要应用领域
遗传图谱绘制的标记,疾病诊断和疾病易感基因的鉴别,药物基因组学研究和新药筛选,药物代谢和药物遗传学,法医鉴定和个体识别,群体遗传学研究和遗传多态性分析,物种鉴定、菌种鉴定等。
三、SNP检测方法
1、测序法：所有SNP的检测方法中，对待检测片段进行直接扩增、测序是最为准确的方法，也是SNP分析的金标准。纯合型SNP位点的测序峰为单一峰型，而杂合型SNP位点的测序峰为套峰（如下图），因而很容易将其区分开来。通过直接测序方法进行SNP检测的检出率接近100%。该技术主要通过直接测序的方法来确定位点的基因型，这种分型方法准确性最高，但费用大。如果需要检测的几个SNP位点正好位于一个测序单元内（长度小于700bp），则单个位点的分型费用可显著降低，这种分型技术不失为一种良好选择。对于准确性要求特别高或样本量特别小（几个或几十个）的项目，这种分型技术很适合。

2、PCR-RFLP：SNP分型最经典的研究方法，具有最大优势在于，不需要有特殊的仪器，检测操作简单，费用低廉，也适合中量样本的检测。缺点是需要大量人力，耗时相对较长，不适合高通量大样本检测。

 
3、TaqMan探针：该技术是由美国应用生物系统公司（ABI）研发的SNP分型技术，其技术原理如下：PCR反应时，加入一对两端有不同荧光标记的MGB特异探针来识别不同的等位基因（allele1和allele2），5’端为报告荧光基团（reporter），3’端为淬灭荧光基团 (quencher)。PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光。特异的探针与相应的等位基因结合后，DNA聚合酶发挥5’到3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离3’端淬灭荧光基团的淬灭作用 (quench)，从而发出荧光。两个探针的5’端标有不同的荧光 (FAM或VIC)，3’端标有MGB 淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP等位基因型。

◇TaqMan® MGB探针特点
（1）探针较短(~13bp)
（2）较短探针提高鉴定的准确性
（3）小沟结合物增加了较短探针的熔点温度(Tm)
（4）TaqMan® MGB探针对富含A/T 的序列有良好的鉴定能力
（5）该技术操作简单快速，软件分析结果界清晰，标出了每个样本的基因型及荧光强度，非常直观，特别适合少量位点大量样本（上千个）的分型项目。下图为软件分析案例。

4、MultiplexSNaPshot分型技术：该技术也是由ABI开发，主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶、四种荧光标记的ddNTP、紧挨多态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经测序仪电泳后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型，根据峰移动的胶位置确定与该延伸产物对应的SNP位点。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。利用SNaPshot检测技术结合高通量样品处理平台，每天的检测通量能够满足中大规模基因分型项目的需要。整个技术的示意图：

多个SNP位点的分型图：
 

 
单个SNP位点分型图：
  
 
 
方法特点：
（1）分型准确  该技术也称小测序技术，直接得到位点的碱基组成，检测结果直观其准确度，仅亚于直接测序。
（2）多位点同时检测  采用多重单碱基检测技术，每次反应可以检测多达10个SNP位点，而RFLP及TaqMan一次仅能检测一个。
（3）不受SNP位点多态特性限制  不管该位点是杂合，还是插入或缺失多态，都可以放在一个体系中检测。
（4）可以检测出受污染的样本  如果一个样本的分型峰谱偏离正常的分布，它可以提示样本可能受到污染或浓度过低，而其它分型方法则不能做到那样。
 

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