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2002年，丹麦Mann实验室的OngSE等对AACT技术作了进一步改进，建立了SILAC技术并首次应用于定量蛋白质组研究，为全面、系统地定性和定量分析复杂哺乳动物细胞蛋白质组提供了有效的方案。
技术原理 SILAC的基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定，根据一级质谱图中两个同位素型肽段的面积比较进行相对定量。属于体内代谢标记法。 图：SILAC定量蛋白质组的实验流程 技术特点 l SILAC是体内标记技术，稳定同位素标记的氨基酸与天然氨基酸化学性质基本相同，所标记的细胞和未标记细胞在生物学行为上几乎没有差异，标记效率可高达100％。 l 采用质谱定量，定量结果准确且批次变异小、重复性好。 l 体内代谢标记与SDS-PAGE或色谱分离技术相结合，兼容疏水性蛋白和偏碱性蛋白，不受蛋白性质限制。 l 多个样品混合后同时进行分离、酶切和鉴定，后续实验对样品的影响一致，减少了实验操作和仪器设备产生的影响。 l 由于该技术属于体内标记，标记效果稳定，其标记效率不受裂解液的影响，不仅适合于进行全细胞蛋白的分析，还适合于膜蛋白的鉴定和定量。 l 与化学标记相比，SILAC方法蛋白需要量明显减少，通常每个样品只需要几十微克的蛋白量。 l 活体标记，更接近样品真实状态。 l 只适用于活体培养的细胞，对于生物医学研究中常用的组织样品，体液样品等无法分析，对于动物模型的标记成本太大，无法实现。 应用 l 多个样品全细胞蛋白或亚细胞蛋白的差异比较。 l 同一样品不同条件下全细胞蛋白或亚细胞蛋白的差异比较。 l 将SILAC与IP技术相结合，可用于研究特定蛋白质的相互作用蛋白分析。 l 通过对质谱谱图的解读，可进行***酸化位点的确认和***酸化蛋白的定量分析等。 客户须知 我公司不提供样本前处理服务，客户需自行进行标记和细胞传代，标记细胞样本需要能传代5代以上的才能进行SILAC实验。
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