疾病多肽标志物检测-糖尿病早期多肽标志物检测

　　一、项目介绍

　　1、糖尿病的的发病情况与危害

　　二型糖尿病(Diabetes mellitus type 2)，旧称非胰岛素依赖型糖尿病(noninsulin-dependent diabetes mellitus，简称NIDDM)或成人发病型糖尿病(adult-onset diabetes)，是一种代谢性疾病。特征为高血糖，主要由胰岛素抵抗及胰岛素相对缺乏引起。一型糖尿病与其为之不同的是，一型糖尿病患者身体因为胰脏里的胰岛细胞已经损坏，所以完全丧失了生产胰岛素的功能。二型糖尿病的典型病征为多尿症、多饮症(Polydipsia)以及多食症(Polyphagia)。二型糖尿病患者占糖尿病患者中的90%左右，其余10%主要为一型糖尿病与妊娠期糖尿病，因此后者可能被误诊 (Genuth et al, 2003)。因遗传因素而易患糖尿病的高危人群中，一般认为引发二型糖尿病的主要原因是肥胖症(Nichols et al, 2007)。二型糖尿病的早期是通过增加运动以及改变饮食习惯来控制病况的(Riserus et al, 2009)。如果这些办法无法把血糖降低至适当水平，可能要用到二甲双胍(Metformin)或胰岛素之类的药物。使用胰岛素的患者一般需要定期检查血糖水平。

　　自1960年以来，糖尿病与肥胖症的发病率同时出现了显著的上升，糖尿病患者从1985年的约3000万名剧增至2010年的约2亿8500万名。高血糖可引起慢性并发症，包括心血管疾病、中风、影响视力的糖尿病视网膜病变、可能需要采用透析治疗的肾衰竭以及可引致截肢的下肢血流不畅。酮症酸中毒为糖尿病急性并发症，一般常见于一型糖尿病病患者，在二型糖尿病患中属于罕见现象。然而，高渗性高血糖状态(Hyperosmolar hyperglycemic state)也是可能会出现的并发症。全球糖尿病的患病率在不断增加，2011年糖尿病患者3.6亿，据估计到2030年这个数字会上升到5.5亿 (ADA;2005)。中国糖尿病患者数量巨大(9240万)并不断在增加。其中，95%是二型糖尿病患者。因此，二型糖尿病预防与辅助的检测试剂盒对临床以及科研都有着重要的意义和良好的市场前景。

　　2、质谱技术检测多肽标志物原理

　　近来，在现代蛋白质组学研究中出现的液体芯片飞行时间质谱检测、电喷雾质谱和飞行时间质谱、四级杆飞行时间质谱、傅立叶变换质谱技术，给临床早期标志物的检测带来了划时代的革命，这些技术将传统的1次只能测定1个蛋白标志的方法革命性地发展到1次可测定数十个，甚至数百个蛋白的多项检测的水平，同时还极大地提高了诊断的灵敏度和特异性。

　　飞行时间质谱仪 Time of Flight Mass Spectrometer (TOF-MS) 是一种很常用的质谱仪。这种质谱仪的质量分析器是一个离子漂移管。由离子源产生的离子加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器。离子质量越大，到达接收器所用时间越长，离子质量越小，到达接收器所用时间越短，根据这一原理，可以把不同质量的离子按m/z值大小进行分离。 由我们公司所开发的液体芯片飞行时间质谱技术(CLINPROT™ MALDI-TOF MS)采用不同功能表面的磁珠(即液体芯片)，对复杂体液如血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液、组织裂解液、细胞培养上清液进行处理，利用基质辅助激光电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)发现潜在的生物标志物，并能够鉴定单个的生物标志物候选物，具有准确性高、稳定性好、灵敏度高、重复性好、高通量、可自动化等特点。

　　3、质谱技术进行“糖尿病早期多肽标志物检测”项目简介

　　在这份研究中，我们将利用MALDI-TOF质谱技术作为检测手段，联合阳离子交换磁珠 (WCX)处理二型糖尿病患者和正常人的血液进行分析，找出二型糖尿病患者和正常人血液多肽谱差异峰，通过样本验证实验确定糖尿病的多肽标志物，并且以此为基础研发出作为二型糖尿病预防与辅助的临床及科研检测试剂盒。

　　二、检测优势

　　糖尿病是一种复杂的代谢性疾病，其中有多类信号通路，蛋白，多肽，DNA，RNA，大分子，小分子以及未知物的参与及影响。 目前二型糖尿病的生物标志物有多个(Kolberg et al, 2009)，其中包括：脂联素(adiponectin) (Krakoff et al, 2003;Mather et al, 2008)，C反应蛋白(C-reactive protein) (Pradhan et al, 2001)，铁蛋白ferritin，白细胞介素-2受体A (interleukin-2 receptor A), 糖化血清蛋白 (Glycated Serum Protein), 生长分化因子15 (Growth differentiate factor 15) (Adela and Banerjee, 2015) 和 MicroRNA 126 (Liu et al;2014) 等等。而目前市场上(国内/国外)的生物标志物试剂盒基本都采用酶联免疫吸附实验(ELISA)。但这些试剂盒所提供的信息都是作为糖化血红蛋白测试的辅助信息来帮助病人预测糖尿病所带来的其他并发症。酶联免疫吸附实验还存在一些局限比如特异性问题和定量准确度问题。而质谱法在生物标志物验证中，已被广泛应用。较酶联免疫夹心法，质谱法可大幅提高定性准确性、定量准确性、并具有更宽的定量线性范围，以及方法开发段和分析通量高的特性。

　　本项目旨在开发临床二型糖尿病质谱检测预诊断多肽试剂盒。在实验设计上需考虑到临床样品的复杂性;在样品处理和检测方法上要简便、快速，能够满足临床检测的需求;检测的灵敏度、特异度均需达到临床诊断试剂盒的要求

　　三、检测流程

　　血清样本将由合作单位301医院提供。采集的样品将通过弱阳离子交换(WCX)磁珠试剂盒(SPE-C; Bioyong Tech, Beijing, China)富集血清中的低丰度的蛋白和多肽，进行多肽提取。

　　样本分为疾病组和对照组;

　　利用moldi-TOF对样本数据进行采集;

　　利用BE软件对采集数据进行分析，建模，找出差异峰(多肽);，

　　筛选出的多肽标志物将通过LC-MS鉴定确认氨基酸序列以及所属的蛋白家族，然后针对这些蛋白进行二型糖尿病的相关性研究，找出差异蛋白，将这些蛋白作为生物标志物研发出糖尿病检测，筛查试剂盒。

　　四、适用人群

　　用于体检时糖尿病筛查的辅助手段