基因甲基化检测(MSP,BSP，焦磷酸测序，LUMA，MassARRAY))

基因甲基化检测

甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧***嘧***环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程.
DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，它不改变DNA的一级结构，却在细胞的发育、基因的表达、及基因组的稳定性中起着重要的作用。
CpG岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象，而启动子CpG 岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。
因此，基因启动子甲基化检测在临床诊断、药物敏感性检测、个性化治疗等方面具有很高的应用价值。

一. MSP法：定性

    该方法是检测甲基化的经典方法，也是zei早采用的基因甲基化检测方法。方法是：通过两对引物，分别对应甲基化序列和非甲基化序列，对重亚硫酸盐转化后的DNA进行PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳分析某个基因的甲基化情况。

图1：MSP PCR产物电泳图 


二. BSP（亚硫酸盐测序法）：定量

该方法是通过PCR产物克隆测序，然后用甲基化分析软件对测序序列与靶序列进行比对分析，可以得到如下数据：
A. 测序序列与目的序列的相似度（）；                             B. C-T转化效率（）；
C. 目的片段中每个CG的甲基化情况（点状图）；            D. 每个CG的甲基化率()； 

                                

              图2a：BSP点状图                                  图2b：BSP序列比对


三.焦***酸测序法：定量

     在表观遗传学的DNA甲基化研究中，新一代的测序方法可得到大量的全基因组甲基化特征数据，需要验证其中特定靶序列与表观遗传修饰的生理相关性。此验证过程较具挑战性，因为甲基化位点的位置和频率的微小改变也会带来明显的变化。焦***酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点，是理想的验证方法。

     因此该技术在表观遗传学研究中逐渐成为数据分析的金标准。

技术优势：

♦ Pyrosequencing 能测定邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至包括测序的引物区域

♦ 启动子序列中接近的不同CpG岛的甲基化频率计算

♦ 适用于新鲜冷冻，和石蜡包埋的样本

♦ 不同的应用实验可同时在一次运行中实现

♦ PCR反应之后，1个小时内可同时平行分析96个样本

应用实例：
 

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