水稻泛素E3酵母文库双杂筛选技术——携手中国农科院

背景介绍

泛素化是一种酶促的、蛋白质翻译后修饰过程，几乎参与了真核生物细胞的所有生命活动，如蛋白酶体依赖的蛋白质降解、细胞周期进程、蛋白定位、转录调控和信号转导等。泛素化过程是由泛素激活酶 (E1)、泛素结合酶 (E2) 和泛素连接酶 (E3) 级联催化完成，最终将泛素分子加到底物蛋白上，从而影响底物蛋白质的稳定性、活性或者细胞定位等。E1、E2和E3的数量存在很大的差异，水稻中有6个E1，49个E2，1515个E3。在整个泛素化级联反应中E3泛素连接酶起决定底物特异性的作用，将泛素分子转移到底物的某个赖氨酸上。通常情况下，泛素连接酶可以将目的蛋白质多泛素化，即加上多个泛素分子，形成多泛素链，从而使带有多泛素链的蛋白质被蛋白酶体所识别和降解。但在一些情况下，泛素连接酶只在目的蛋白质上连接一个泛素分子，这种单泛素化的蛋白质不会被蛋白酶体降解，但其在细胞中的定位或功能却可能发生改变，例如，单泛素化的蛋白质可以通过结合其他具有泛素结合结构域的蛋白质来改变自身位置。根据蛋白亚基结构组成，E3分为两大类，单亚基E3（HECT、RING、U-box）和多亚基E3（SCF (SKP1–CUL1–F-box)、 CUL3–BTB、CUL4–DDB1–DWD、APC/C）。

图1 | 泛素化系统示例图

泛素化的作用广泛，在动植物中均是研究热点，水稻E3泛素连接酶对水稻生长发育等方面的调控作用也是水稻科研工作者的研究重点，近3年来发表的水稻E3文章已余百篇（部分见文末）。

为快速鉴定水稻泛素化蛋白的E3泛素连接酶，建立水稻泛素化互作组，促进水稻科研工作发展，欧易生物携手中国农业科学院植保所宁约瑟老师团队，共同构建了水稻泛素E3连接酶文库，该文库包含了约1500个E3泛素连接酶ORF，占目前已知所有E3连接酶基因总数的98.94%，包含单亚基和多亚基共7种类型，如下表。该文库构建于pGADT7载体上，可用于酵母双杂交筛选蛋白底物对应的特异性E3泛素连接酶。

基因序列数据来源：MSU Rice Genome Annotation Project Release 7 data
（RGAP 7, http://rice.plantbiology.msu.edu/）。
 

文库参数：

·文库构建于pGADT7载体上，可用于酵母双杂交筛选蛋白底物对应的特异性泛素连接酶；

·包含约1500个E3泛素连接酶ORF；

·占目前已知所有E3连接酶基因总数的98.94%；

·包含单亚基和多亚基共7种类型，如下表：

表1 | 水稻泛素E3连接酶文库组成

结果展示

该项工作成果于2022年7月，以“An ORFeome of rice E3 ubiquitin ligases for global analysis of the ubiquitination interactome”为题发表于Genome Biology。

文中详细介绍了E3文库的构建方式、组成、注释信息等，并使用已知的4种与水稻干旱、高盐和抗病等相关的泛素化蛋白为诱饵，对泛素E3连接酶文库进行了筛选验证，结果利用该文库可以高效的筛选到已知的和新的E3泛素连接酶，文中还通过体内和体外实验对互作和蛋白降解进行了验证。其中OsSKIPa共筛选到了51个互作阳性克隆，编码11个E3泛素连接酶；OsNRPD1a共筛选到了92个互作阳性克隆，编码8个E3泛素连接酶；NRR共筛选到了173个互作阳性克隆，编码11个 E3泛素连接酶；rRGA2.1共筛选到了85个互作阳性克隆，编码7个E3泛素连接酶。此外，还利用该文库鉴定了丙胺酶家族蛋白PALs的核心E3泛素连接酶OsFBK16，揭示了OsFBK16通过降解OsPALs负调控水稻抵抗稻瘟病的分子机制。

图2 | 水稻泛素E3连接酶文库组成筛选流程及验证

参考文献[1] An ORFeome of rice E3 ubiquitin ligases for global analysis of the ubiquitination interactome. Genome Biology. 2022[2] An evolutionarily conserved C4HC3-type E3 ligase regulates plant broad-spectrum resistance against pathogens. Plant Cell. 2022[3] The RING E3 ligase CLG1 targets GS3 for degradation via the endosome pathway to determine grain size in rice. Mol Plant. 2021[4] Two VOZ transcription factors link an E3 ligase and an NLR immune receptor to modulate immunity in rice. Mol Plant. 2021[5] Ca²⁺sensor-mediated ROS scavenging suppresses rice immunity and is exploited by a fungal effector. Cell. 2021[6] Silencing an E3 Ubiquitin Ligase Gene OsJMJ715 Enhances the Resistance of Rice to a Piercing-Sucking Herbivore by Activating ABA and JA Signaling Pathways. Int J Mol Sci. 2021[7] A U-box E3 ubiquitin ligase OsPUB67 is positively involved in drought tolerance in rice. Plant Mol Biol. 2020