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EPO中N-糖基化和O-糖基化修饰表征策略
人促红素（EPO）是一种糖蛋白，可刺激红细胞生成，是多种贫血病临床治疗的主要药物。EPO分子有4个糖基化位点，其中3个N-糖基化位点（Asn24, Asn38, Asn83）和1个O-糖基化位点（Ser126），EPO分子量的40%为糖类。糖基化对稳定EPO的体内生物活性具有重要作用，倘若缺乏糖链，则EPO在体内迅速被水解而失活。EPO中N-糖为复杂型寡糖，该类型寡糖在组成上可分为糖核部分、天线部分及末端唾液酸部分，而且末端唾液酸的O-乙酰化、O-甲基化等修饰程度高，导致EPO存在高度异质性，给糖型表征带来很大挑战。
SCIEX合作中国食品药品检定研究院（NIFDC） 重组药物室，以ZenoTOF™ 7600系统特有的电子活化解离（EAD）碎裂技术1，可控的电子能量输出，不仅可以提供b-离子/y-离子，c-离子/z-离子，而且可以提供完整的分子离子信息，为糖肽水平的糖型准确鉴定提供了强有力工具。Biologics Explorer软件提供流程式的分析方法，可以在1个分析方法中同时分析O-糖基化和N-糖基化修饰。
ZenoTOF™ 7600系统EAD碎裂技术可以使复杂糖肽产生丰富的二级离子信息，可以准确定位糖基化位点和糖型确认。
SCIEX Biologics Explorer软件提供流程式的分析方法，实现一个方法同时分析N-糖基化和O-糖基化修饰。
ZenoTOF™ 7600质谱系统结合Biologics Explorer软件功能，能够快速对复杂糖蛋白进行糖基化修饰的深度表征，这些信息助力于不同厂家或者不同批次间蛋白产品中糖型差异的监测。️
1. O-糖基化修饰
EPO含有1个O-糖基化位点，EAD数据可准确定位糖基化发生在S126位。肽段AISPPDAASAAPLR包含2个丝氨酸（Ser，S），这2个S是O-糖基化的潜在位点。图1展示EAD技术对糖肽碎裂产生丰富的二级离子信息，可以准确定位糖基化位点和糖型确认。图1中b-离子/c-离子用蓝色线标识，y-离子/z-离子用红色线标识，带有寡糖片段的肽段用黄色线标识，完整的糖肽分子用绿色线标识。通过EAD产生的二级谱图中y11-，y12-离子的质量信息，y12-离子（m=1808.8346）与y11-离子（m=1721.8040）的质量差为87.0306，正好是1个S-残基的分子质量，确认S120不是糖基化位点。同理，根据c8-，c9-，c10-离子的分子量信息，c9-离子（m=1483.6587）与c8-离子（m=740.3953）的质量差为743.2634，该分子量差值是S-残基分子量与674.2328（Core1_S1残基分子量）之和，因此，可以定位糖基化位点为S126。
使用SCIEX Biologics Explorer软件可以鉴定到S126位点主要含有三种糖型，分别为Core1, Core1_S1和Core1_S2，软件自动计算出三种糖型的比例。由表1，可以看出每种糖型的比例在3个样品间存在明显差异。根据各种糖型比例，可以计算出3个样品在S126位点的O-糖基化比例相近，约为81%，无O-糖基化的比例约为19%，同时在原始谱图中可以确认到无O-糖基化的肽段信息。
2. N-糖基化修饰
除O-糖基化修饰外，EPO还含有N-糖基化修饰，主要含有3个位点，分别为：N24，N38和N83。这些位点不仅包含多种不同的糖型，而且EPO的糖型含有较多的O-甲基化或O-乙酰化，这些特征增加了EPO的异质性，使得糖型分析变得更加复杂。ZenoTOF™ 7600质谱系统结合Biologics Explorer软件使得糖型分析变得流程化、简单化。软件搜库时可以设置N-糖型库的修饰，如甲基化、乙酰化2含修饰的N-糖型信息和不含修饰的N-糖型信息一并展现在鉴定结果中。本文研究了3个EPO样品在三个N-糖位点上包含的主要糖型及其比例的差异。
2.1 N24位点的糖型及比例
EAD数据可准确定位糖基化位点，以N24位点为例，如图2右边谱图所示，肽段AENITTGCAE覆盖到很多二级离子信息，由c2-离子，c3-离子的分子量信息可以准确定位糖基化发生在N24位点。图2左边展示Biologics Explorer软件鉴定得到，该糖型为含有O-甲基化修饰的A4G3F1_OMe1，右边展示糖肽的二级谱图。N24位点同时鉴定到不含修饰的糖型A2G2F1S1，图3展示了对应糖肽的二级谱图。
Biologics Explorer软件可以同时处理多个批次的样品数据，展示样品间的糖基化比例差异，表2列出了N24位点主要糖型及其比例。比例较高的糖型，包括O-甲基化修饰的A4G3F1_OMe1，O-乙酰化修饰的M4A1G1_OAc4，不含修饰的A2G2F1S1，A4G4F1S2等。但是3个样品中比例最高的糖型不完全相同，如A4G3F1_OMe1在EPO1和EPO3中比例最高，而EPO2比例最高的是A2G2F1S1。3个样品在N24位点的糖基化比例约为78% ~ 83%，样品中存在N24无糖基化的肽段，可以在原始谱图中确认到无糖基化的肽段信息。
2.2 N38位点的糖型及比例
N38位点大部分糖型为O-乙酰化修饰。与N24位点的糖基化比例不同，N38位点的糖基化比例接近100%，比例最高的前四种糖型：A5G5F1S4_OAc2、 A5G5F1S3_OAc2、A6G6F1S3_OAc2和A7G7F1S4_OAc2，其比例加和在3个样品中均超过73%。其他糖型的比例均低于10%。
2.3 N83位点的糖型及比例
与N38位点糖基化修饰的程度类似，N83位点的糖基化修饰比例也接近100%，存在多个糖型同时包含O-甲基化和O-乙酰化修饰。
两种糖型A4G4F1S3Sg1_OAc1OMe1和A4G4F1S2Sg1_OAc1OMe1在3个样品中比例较高，均超过20%，此外，3个样品中A4G4F1S3和A3G3F1S2Sg1_OAc1OMe1两种糖型的比例也超过了11%，其他糖型均低于10%。
总结
1. ZenoTOF™ 7600质谱系统提供电子活化解离（EAD）碎裂技术，准确定位N-糖基化位点和O-糖基化位点，提供完整的糖型离子信息。
2. SCIEX Biologics Explorer软件提供的流程式的分析方法，可以实现一个分析方法同时分析N-糖基化和O-糖基化修饰。
3. 通过对3个不同批次的人EPO产品进行糖基化修饰的表征分析，发现相同样品在不同糖基化位点的糖型不同；相同糖基化位点的同一个糖型，其比例在不同样品间也存在差异。
参考文献✦
1. Baba, T. et al. Dissociation of biomolecules by an intense low-energy electron beam in a high sensitivity time-of-flight mass spectrometer. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2021, 32, 8, 1964–1975.
2. Peptide mapping study on human erythropoietin (EPO): a complex N- and O-linked glycoprotein. SCIEX technical note RUO-MKT-02-13650-B
| 标签： | 糖基化 EAD |
