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——借助质谱shotgun技术研究昆虫蜕皮液中与保护和调节蜕皮进程相关的蛋白质组 

文章来源：Functional analysis of insect molting fluid proteins on the protection and regulation of ecdysis. J Biol Chem. 2014; 289(52): 35891-906.

文献摘要：

背景：蜕皮液通常会在蜕皮动物周期性蜕皮时积累在新旧两层表皮之间。目前已经发现诸多现象暗示蜕皮液可能影响昆虫蜕皮期间的免疫系统以及蜕皮羽化。

内容：为了揭示蜕皮液与蜕皮生理进程之间的实际联系，该课题组利用shotgun技术针对家蚕三种不同时期的蜕皮液进行了蛋白质组分析。

结果：实验中每一种蜕皮液均发现多种新的蛋白质，其中很大一部分与免疫相关。而蜕皮液也可在体外抑制细菌生长。真菌Beauveria bassiana 是一种昆虫病原，可以有效躲避feeding larvae 的免疫系统，但是在蜕皮期可以被迅速识别并导致家蚕幼虫蜕皮液和老表皮壳的黑化。真菌孢子萌发过程被延迟，并且在幼虫血腔中也没有发现菌丝。蜕皮液可以保护只有极薄表皮层的幼虫免受微生物的入侵。

本次蛋白质组分析中发现了众多可能与蜕皮调节相关的蛋白质，但由于家蚕本身转基因系统不甚发达，因此该课题组又在赤拟谷盗（一个被广泛采用的研究昆虫外皮发育的动物模型）中针对其中32个基因进行了RNAi，以分析这些基因在体内的具体作用。最终他们发现这32个蛋白质中的24个蛋白质通过影响旧体壁蛋白循环、蜕皮液压稳定、脱毒、信号转导等多个方面调控蜕皮过程。

结论：该研究不仅分析了蜕皮液中可以影响蜕皮的蛋白质，也为针对蜕皮过程的杀虫剂研究积累了很多有用数据。

实验思路：

实验结果：

1. 不同时期家蚕蜕皮液蛋白质组成分析

此次实验发现了家蚕蜕皮液中含有众多的蛋白质组分，其中很多为解毒相关免疫相关的蛋白质。也有很多蛋白质为首次发现，功能未知。

Fig. 2. Protein identification in molting fluids. A, approximately 20 μg of each type of molting fluid was separated on 12% SDS-polyacrylamide gels. Each gel lane was cut into several bands as indicated for LC-MS/MS assays. B, comparison of the number of proteins identified in each type of molting fluid. The overlap shows entries with the proteins from two or three groups. C-E, gene ontology categories of proteins identified in the indicated molting fluids.

并且通过生理实验发现蜕皮液确实可以抑制病原微生物对家蚕的侵染和生长：

Fig. 5. Delayed germination of B. bassiana on the skins of larvae undergoing ecdysis. B. bassiana conidia were applied to the surfaces of larvae undergoing ecdysis or on feeding stages and tissue were sectioned. A-E, surface application of B. bassiana to larvae undergoing the 4th larval-larval ecdysis. Conidia germination was delayed until 24h postapplication, but systematic melanization occurred quickly. F-J, application of B. bassiana to feeding larvae (v-2). Conidia germination was observed between 6 and 12h. Melanization occurred after hyphae passed through the cuticle. K-O, surface application of B. bassiana to larvae undergoing larval-pupal ecdysis. Conidia germination was delayed until 48h. In A and K, insects at different molting stages became melanized after B. bassianaapplication (a), and the same insects are shown after the old cuticles were manually removed (b). The arrows indicate the conidia (C, G, and M) and newly germinated hyphae (D, H, and O) on the surfaces of larvae. The arrowheads indicate hyphae inside the cuticle (E, I and J). OC, old cuticle of ecdysis larvae; NC, new cuticle of ecdysis larvae; C, cuticle of feeding larvae; E, epidermal cells. Scale bar, 10 μm.

2. 在赤拟谷盗中分析家蚕蜕皮液中蛋白质的生理功能

家蚕转基因操作不是很方便，而家蚕和赤拟谷盗在蜕皮液组成上非常的相似，同时赤拟谷盗转基因操作系统比较成熟，因此在赤拟谷盗中敲除相关蛋白质的同源蛋白来分析相关蛋白质的生理功能，最后发现蜕皮成功需要蜕皮液中的众多蛋白质共同调节完成，几丁质循环会显著影响蜕皮，蛋白质循环则是蜕皮的先决条件，ROS调控对于蜕皮来说也是非常重要，脱毒是蜕皮不可缺少的步骤，蜕皮液压的平衡则能保证蜕皮的顺利完成，信号转导也对蜕皮具有非常显著的调控作用，根据以上结论，该课题组推断出了蜕皮液调节蜕皮的模型。

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