J Hepatol（IF25.7）| 基于机器学习算法鉴定外泌体蛋白标志物用于胆管癌的风险预测、早期诊断和预后

发布时间： 2023-07-11 16:18:22 来源：中科新生命蛋白代谢多组学

胆管癌（CCA）是一种预后较差的异质性胆道肿瘤，目前缺乏准确的早期诊断方法。肿瘤生物标志物碳水化合物抗原19-9（CA19-9）是目前用于帮助CCA诊断的唯一液体活检工具，但其诊断能力很低，特别是在CCA早期阶段。因此，开发一组生物标记物用于CCA早期诊断，对高危人群，即原发性硬化性胆管炎（Primary Sclerosing Cholangitis，PSC），尤其重要。来自西班牙巴斯克大学的研究人员通过对患者血清细胞外囊泡（EV）中的蛋白质进行质谱筛选，获得了一系列蛋白生物标志物，可用于CCA的预测、早期诊断和预后估计，打开了肿瘤细胞来源的液体活检工具。相关内容以“Liquid biopsy-based protein biomarkers for risk prediction, early diagnosis and prognostication of cholangiocarcinoma”为题，在线发表在国际肝胆脏疾病期刊Journal of Hepatology（IF：25.7）杂志上。

研究材料

PSC患者（n=45）、PSC相关CCA患者（PSC-CCA）（n=44）、随访期间发生CCA的PSC患者（PSC to CCA；n=25）、非PSC病因的CCA患者（n=56）、肝细胞癌患者（n=34）和健康个体（n=56）

技术路线

步骤1：循环EV蛋白可用于CCA风险预测、早期和鉴别诊断以及预后；

步骤2：血清CRP/纤维蛋白原/FRIL水平区分早期PSC-CCA患者和PSC患者；

步骤3：大多数Pan-CCA生物标志物主要在CCA内的恶性胆管细胞中表达；

步骤4：EV蛋白COMP/GNAI2/CFAI和ACTN1/MYCT1/PF4V的丰度可独立预测CCA患者的总生存率。

重要结果展示

1. EV蛋白的差异丰度揭示了诊断CCA的候选生物标志物

通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）和免疫印迹对从PSC-CCA患者、PSC患者和健康个体中分离的血清EV进行表征，证实了富集EV的高纯度（图1A-C）。然后通过质谱（MS）对EVs的蛋白质组学图谱进行表征，PSC-CCA患者、PSC患者、健康个体显示了不同的EV蛋白谱（图1D）。接下来，对单个候选生物标志物的诊断能力进行了研究，其中47种EV蛋白在CCA诊断中显示出显著的AUC值，FRIL表现出最优异的诊断能力（图1E）。

图1 血清外泌体富集及外泌体蛋白谱分析

2. 血清EVs含有蛋白质生物标志物，可用于CCAs的早期、准确和病因诊断

为了测试这些候选CCA生物标志物是否对PSC患者具有特异性，或是否对非PSC病因的CCA具有共同的诊断能力，对来自PSC、PSC-CCA或非PSC CCA个体或健康个体的EV进行蛋白质谱分析。其中，5种蛋白质能特异性地鉴别PSC-CCA患者（图2A）。7种蛋白质允许对非PSC CCA进行特异性鉴定（图2B）。对于Pan-CCA的蛋白质谱分析结果表明大多数生物标志物对所有CCA都是通用的（图2C）。重要的是，当仅考虑局部疾病患者（LD）时，大多数候选生物标志物保留了其诊断准确性（图2A–C）。

图2 根据肿瘤病因筛选CCA的血清EV蛋白生物标志物

3. 通过免疫印迹和ELISA在总血清中检测Pan-CCA EV生物标志物，有助于诊断

接下来，文章评估了Pan-CCA EV生物标志物是否仅在血清EV中检测到，它们是否适合血清样本。免疫印迹结果证明，血清EVs含有蛋白质生物标志物，用于预测PSC中的CCA发展，以及PSC患者、没有PSC患者和CCA患者的早期肿瘤检测，无论其病因如何，这些都可以使用总血清进行检测。（图第3A和B段）。同时，这些生物标志物使用ELISA方法进行交叉验证。

为了提高诊断能力，对70%的样本（训练集）进行基于机器学习的逻辑模型的构建，在30%的样本以及仅包含LD-CCA样本的子集（测试集）对模型进行进一步评估。CRP/FRIL可以高精度识别Pan-CAA（图4A）。如果存在PSC，则CRP/FIBRINOGEN/FRIL（LM1）或CRP/FRIL（LM2）的组合可以非常准确地诊断PSC-CCA，特别是在LD-CCA中（图4B）。当临床证实没有PSC时，与健康个体相比，CRP/PIGR/VWF对CCA提供了几乎最大的诊断能力，仅CRP/VWF也可能有助于诊断非PSC病因引起的CCA（图4C）。

图3 使用总血清检测候选EV蛋白生物标志物

图4 血清蛋白生物标志物能够准确诊断患有或没有PSC的CCA患者

4. 其他结果

为了破译CCA候选血清EV蛋白生物标志物的潜在来源，首先在人类多器官（n=61个组织/器官）转录组数据集中分析ELISA验证的生物标志物表达（图5A）。数据显示，所有这些EV蛋白生物标志物都在肝胆组织中表达。CCA肿瘤的scRNA-seq和免疫荧光分析显示，它们主要存在于恶性胆管细胞中（图5C）。多变量分析揭示了EV预后生物标志物，COMP/GNAI2/CFAI和ACTN1/MYCT1/PF4V分别与患者的生存率呈负相关和正相关（图5D）。

图5 EV蛋白生物标志物主要存在于肝胆组织

结论

精确、无创和早期诊断CCA仍然是一个重大挑战，尤其是在高危患者中，如PSC患者。在此，作者进行了一项国际多中心研究，确定了诊断CCAs的准确EV蛋白生物标志物。通过高通量蛋白质组学，预测PSC患者CCA发展的新生物标志物；用于PSC相关CCA、非PSC CCA和泛CCA的早期准确诊断。重要的是，通过ELISA测量总血清中候选生物标志物的水平，对这些结果进行了交叉验证，证实了这些生物标志物可以在原始生物液中检测到，确保了它们有可能转化为临床。总之，该研究可能会帮助更多患者有可能获得治疗选择或接受更成功的治疗，降低CCA相关的死亡率。

中科新生命

中科新生命与中科新生命特聘技术专家顾问、美国普渡大学终身教授陶纬国老师深度合作、潜心研发，完成从外泌体提取、表征到数据挖掘的外泌体多组学一站式解决方案，推动外泌体在精准医学领域的快速发展。