AAV衣壳滴度自动化标准化分析方案

重组AAV载体（rAAV）已经成为使用最广泛的基因治疗病毒载体之一，由于载体本身结构和生产工艺复杂性，没有合适标准品作为对照，在研发阶段、临床前动物和临床病人阶段，准确标准化定量不同研究人员和实验室病毒载体剂量一直是主要问题。Tony Hitchcock等（BioProcess International, 2017）说明了由于AAV载体异质性，导致能感染目的细胞并转导表达目的蛋白的病毒量很少，下图说明只有小比例细胞可完成有临床价值的目的蛋白表达。

      临床前和临床研究重要前提是病毒含量准确检测，作为AAV基因治疗开发中的关键质量属性，准确检测病毒含量需要从不同维度和采用多种分析方法来评估。病毒生物功能学检测主要是通过感染培养的细胞，重组基因组在细胞内复制或转导的目的异源基因表达，这两种类型检测分别为感染性或病毒转导滴度。相反，物理方法不依赖于病毒的生物学功能，病毒DNA通过衣壳消化酶处理后提取，常规的检测技术是qRCR和数字PCR，称为基因组滴度检测；对于病毒衣壳滴度检测采用ELISA方法、HPLC、SEC-MALS和NTA等技术；为了评估病毒感染的效价，必须要检测感染滴度。

      D Grimm 1999说明AAV2衣壳蛋白可能引发宿主体液免疫原性反应，迫切需要检测AAV制剂中总AAV衣壳的准确数量。目前检测病毒衣壳滴度最普遍采用传统孔板ELISA实验，特别是PROGEN公司开发ELISA检测试剂盒。但是这些ELISA方法动态范围窄、手动操作步骤多、耗时长和不易标准化，行业都在开发更快速、重复性更好和通量更高的检测方案，自动化检测方案为病毒衣壳检测领域铺平了道路。

      Bio-Techne公司旗下ProteinSimple为了加速AAV衣壳滴度分析，利用PROGEN公司经过严格验证金标准抗体，结合全自动微流控ELISA技术平台Ella，成功开发了AAV自动化快速检测试剂盒。目前广泛使用的血清型是AAV2，可靶向眼、肾和中枢神经系统等组织。Ella AAV2检测方案可检测AAV2病毒生产过程中衣壳完整的AAV2滴度，将双抗体夹心ELISA法和Ella微流控技术结合，实现了AAV2病毒衣壳滴度的自动化快速可重复检测。

对比PROGEN传统手动ELISA，Ella自动化方案总结

      以上技术对比可说明，与传统ELISA方法比，在操作复杂、费时和重复性差等方面Ella都有明显提升，其检测方案具有更高自动化程度，具有更宽检测范围，可更快速获得实验结果。特别适合AAV病毒载体工艺优化和CMC生产过程中衣壳滴度检测，而且Ella软件符合21 CFR Part 11，安全性高，符合GMP要求。

      除AAV2自动化快速检测方案外，Ella已经成功开发HEK293 HCP自动化检测方案，致力于实现AAV基因治疗产品的工艺和质控测试自动化。