肿瘤生物标志物创新性检测方法及案例分享

肿瘤生物标志物是反映肿瘤存在的生化物质，涵盖了核酸、蛋白质、糖、小代谢物、细胞遗传学和细胞动力学参数，以及体液中发现的整个肿瘤细胞。这些生物标志物可用于风险评估、诊断、预后以及预测癌症的治疗效果，毒性和复发，特别是早期发现肿瘤可大大降低癌症死亡率并挽救生命。

如何精准快速检测到这些标志物，结合基因组学、蛋白组学和代谢组学等技术手段，是目前生物医药研究的重点。近年来，随着蛋白检测技术的发展，越来越多的蛋白标志物研究成为肿瘤研究中新型生物标志物以及药物靶点的开发方向。肿瘤标志物常常存在于血清、体液、尿液、细胞或组织中，针对不同样本来源和蛋白分子特点，ProteinSimple开发了多种快速、高灵敏、高精准的创新性蛋白检测技术，致力于加快蛋白标志物基础研究和临床转化。

全自动循环生物标志物定量检测技术：Ella

人体血液、尿液和唾液中蛋白质已广泛用于临床检测，特别是癌症的筛查和诊断。针对这些样本来源标志物检测技术，目前主要以化学发光免疫分析、电化学发光、荧光免疫分析和酶联免疫分析方法（ELISA）等技术为主。但目前传统的免疫分析方法如ELISA检测某些样本还有局限，灵敏度不够高，导致静息状态下低丰度细胞因子比如IL-6，IL-5等无法准确定量。ProteinSimple开发的全自动高灵敏微流控ELISA系统Ella，已被耶鲁大学，纽约西奈山伊坎医学院等全球知名研究机构采用，为高灵敏、高重复性、自动化程度最高的快速ELISA系统，可解决目前传统ELISA系统对循环蛋白生物标志物的检测需求。

案例一：预测早期卵巢癌肿瘤标志物

耶鲁大学医学院利用Ella平台研究卵巢癌病人样本，研究发现CA125, HE4, E-CAD和IL-6构成的4因子组合可作为预测早期卵巢癌的肿瘤标志物，比单因子CA125、单因子HE4、或者2因子CA125 + HE4更有优势。

案例二：人类腹主动脉瘤预测评估生物标志物

牛津大学科学家通过Ella检测人体腹主动脉瘤的蛋白质标志物（circulating proteins）：CXCL10, IL6,IL8,Thrombospondin, RAGE, MIP1a, MIP1b, leptin和ICAM1，并结合生理指标（FMD, AAA size），可对人体腹主动脉瘤的生长情况做预测评估。

全自动蛋白标志物定量筛选检测技术：Jess & Peggy Sue

对于肿瘤标志物筛选的早期研究阶段，经常面临没有商品化ELISA试剂盒或自行包被ELISA试剂盒时缺少抗体对（只有一个抗体）的情况，从而给研究人员带来很大困扰。ProteinSimple公司开发的全自动Western Blot定量系统，只需要特异性的一抗，采用3-5μL 上样量，同时进行高达96个样本通量，快速定量检测蛋白标志物，是肿瘤生物标志物早期定量筛选的有力工具。

案例一：多发性骨髓瘤病人样本分选CD138阳性细胞生物标志物定量筛选

多发性骨髓瘤患者的骨髓样本，经过CD138+细胞分选后，一般情况下会面临：样本量少和浓度低的限制，而无法做蛋白质浓度的检测。西班牙萨拉曼卡癌症研究中心-IBMCC科学家利用ProteinSimple全自动Western Blot系统，建立了多发性骨髓瘤患者生物标志物的绝对定量检测模型，评估了12种潜在肿瘤蛋白质生物标志物的生物学和临床价值。建立了一种快速、高效、准确定量的药物靶点发现方法。

案例二：检测肝癌外泌体生物标志物

HMGB1是一种进化保守的DNA结合核蛋白，也是癌症、关节炎和败血症等多种疾病状态的损伤分子模式（DAMP）蛋白。HMGB1可在肿瘤来源的外泌体膜上表达，被肿瘤细胞释放到局部微环境中，可影响肿瘤细胞存活，扩增和转移。中山大学附属第三医院肝外科和肝移植中心科学家利用ProteinSimple全自动Western Blot系统，鉴定了不同肝癌细胞系外泌体蛋白标志物以及外泌体中肿瘤标志物HMGB1的表达情况，并与后续的实验结合，共同揭示了肿瘤外泌体HMGB1通过促进TIM-1+ Breg细胞增殖来促进人肝细胞癌（Human HepatocellularHarcinoma, HCC）逃避免疫识别，为利用外泌体预防和治疗HCC的免疫耐受性提供概念验证。

肿瘤单细胞蛋白标志物定量检测技术：Milo

肿瘤细胞异质性是恶性肿瘤的标志之一，也是恶性肿瘤耐药的细胞学基础。研究肿瘤细胞的异质性，已成为肿瘤治疗必须解决的问题。肿瘤单细胞之间信号通路失调和变化已成为研究癌症发生发展的方向。单细胞核酸检测可进行细胞异质性研究，但不能直接测量蛋白质介导的信号传导包括蛋白翻译后修饰，蛋白质定位和蛋白质-蛋白质相互作用。而大多数癌症疗法以蛋白质为目标来研究肿瘤异质性以及药物反应和耐药性。ProteinSimple公司开发的单细胞Western Blot系统Milo，是全球研究单细胞异质性的重要工具。

案例一：肿瘤活检样本细胞异质性研究

美国加州大学伯克利分校及斯坦福大学医学院肿瘤学系科学家共同利用Milo，对HER2阳性乳腺癌穿刺组织，检测HER2表达异质性，以及HER2信号通路蛋白：mTOR，ERK，elf4E，β-Tub（内参），从而进行蛋白表达异质性分析。

案例二：循环肿瘤细胞（CTC）蛋白标志物分析

加利福尼亚大学伯克利分校生物工程系和斯坦福大学医学院科学家，通过利用Milo检测单个循环肿瘤细胞（CTC）多种蛋白标志物，为液体活检提供更精准的诊断标志物。

翻译后修饰的蛋白标志物定量检测技术：NanoPro1000

当蛋白质发生磷酸化、泛素化、乙酰化、SUMO化等修饰后，通常在一些炎症、慢性疾病和癌症中起到了关键调控作用。ProteinSimple公司开发的蛋白质翻译后修饰及信号转导通路研究系统NanoPro1000，可通过研究蛋白翻译后修饰的变化作为肿瘤生物标志物，来进行肿瘤精准分型和靶向治疗。

案例一：多蛋白复合物epichaperome作为肿瘤治疗精准分型标志物

多蛋白复合物（epichaperome），是伴侣蛋白组(chaperome)在应激状态下形成的紧密且稳定的蛋白复合物，由全球顶级肿瘤研究机构斯隆·凯特琳癌症研究所科学家发现并命名。这个团队利用了NanoPro1000对HSP90大蛋白复合体进行深入研究，并结合PET-CT对肿瘤进行分子分型。结果显示当HSP90的PI>4.98时，进行HSP90抑制剂的治疗具有良好效果，相关成果发表在Nature上。

案例二：蛋白磷酸化修饰作为肿瘤标志物

目前蛋白质检测方法对于检测癌症蛋白激活中的细微变化不敏感，而这些细微变化是关键的癌症信号转导过程的研究基础。同时现有检测方法需要大量样本，无法进行连续的肿瘤取样以评估对治疗药物的反应。美国斯坦福大学科学家利用NanoPro 1000，评估临床肿瘤标本中蛋白质组学变化。结果显示当给予atorvastatin前后，pSTAT5和pSTAT3磷酸化水平有大幅降低，所以，pSTAT5和pSTAT3磷酸化水平可作为药物治疗标志物。

参考文献：

1.Cancer biomarker detection: recent achievementsand challenges, Chem Soc Rev. 2015 May 21;44(10):2963-97.

2.A novel multiple biomarker panel for theearly detection of high-grade serous ovarian carcinoma, Gynecol Oncol. 2018Jun;149(3):585-591.

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4.A novel nano-immunoassay method forquantification of proteins from CD138-purified myeloma cells: biological andclinical utility, Haematologica. 2018 May;103(5):880-889.

5.Tumor-derived exosomal HMGB1 fostershepatocellular carcinoma immune evasion by promoting TIM-1 + regulatory B cellexpansion, J Immunother Cancer. 2018 Dec 10;6(1):145.

6.Hydrogel Pore-Size Modulation forEnhanced Single-Cell Western Blotting, Adv Mater. 2016 Jan 13;28(2):327-334.

7.Profiling protein expression incirculating tumour cells using microfluidic western blotting, Nat Commun. 2017Mar 23;8:14622.

8.The epichaperome is an integratedchaperome network that facilitates tumour survival, Nature. 2016 Oct20;538(7625):397-401.

9.Nanofluidic proteomic assay for serialanalysis of oncoprotein activation in clinical specimens, Nat Med. 2009May;15(5):566-71.

ProteinSimple总部位于美国硅谷，是世界一流的生命科学仪器制造商，专注于蛋白质研究分析领域。作为Bio-techne(NASDAQ：TECH)旗下，世界领先的专业公司之一，ProteinSimple致力于发展先进的蛋白质分析技术。在蛋白质分离、定量、成像、聚集和分析领域建立了一整套独特的解决方案。