突破！新DNA提取方法结合微流控PCR 可检出12 CFU/ml致病菌

近日，中国农业大学林建涵教授团队研发出一种新型的食源性致病菌检测技术，先利用同轴通道和二氧化硅磁珠进行DNA提取和富集，再利用融智生物微流控核酸定量分析平台QuanPLEX和微流控芯片进行DNA扩增和检测，可在2 h内检出低至12 CFU/mL的大肠杆菌O157：H7，实现了食源性致病菌的快速、灵敏检测。相关研究结果已经发表在农业、奶制品与动物科学领域国际顶级期刊Journal of Dairy Science，论文题为“Rapid and sensitive detection of E. coli O157:H7 using coaxial channel based DNA extraction and microfluidic PCR”。

近年来，病原菌污染引起的食源性疾病爆发导致了巨大的经济损失，对人类健康构成了巨大威胁。确保食品安全的一个关键是快速筛查受污染的食物。然而，细菌的金标准检测方法--平板培养法耗时且不能用于现场检测。因此，开发快速、灵敏的食源性致病菌检测方法至关重要。

聚合酶链式反应（PCR）是一种快速、灵敏、高通量的方法，已广泛用于食源性致病菌的快速检测。细菌的PCR检测流程主要包括核酸提取、扩增和检测。目前，不同的PCR方法，包括常规PCR、实时PCR、多重PCR、免疫PCR和微流控PCR等，均有文献报道应用于各种细菌检测。随着微流控技术的快速发展，微流控PCR因其检测时间短、自动操作、交叉污染少、成本低等特点而受到越来越多的关注。然而，从复杂食品样本中提取核酸技术却较少得到关注，但这是PCR检测的前提，并且对灵敏度和特异性具有很大影响。

常规的核酸提取方法主要包括十六烷基三甲基溴化铵法、碱法和苯酚-氯仿法，这些方法通常操作较复杂、劳动强度较大、耗时较长且存在重现性和毒性试剂等局限性。更重要的是，它们不适于从大量样本中提取少量靶DNA。在过去的几十年中，二氧化硅磁珠（MSB）经常被报道用于快速提取DNA。简言之，首先利用含有蛋白酶K的裂解液裂解细菌样本使其释放DNA，然后利用MSB通过静电作用或疏水作用捕获DNA，再利用乙醇洗涤除去多余的蛋白质和多糖，最后利用少量洗脱缓冲液（如去离子水）从MSB上洗脱DNA，并利用磁分离即可得到纯化和浓缩的DNA。

最近，基于MSB的微流控装置已被报道用于DNA提取，并且在厘米级芯片上实现靶DNA的自动提取。这些装置具有更短的提取时间、更少的试剂消耗和更简单的操作，但通常具有低灵敏度，因为它们只能处理非常小体积的样本（微升级，甚至纳升级）。

（a）基于同轴通道的细菌检测方法原理示意图；（b）细菌检测系统结构示意图；（c）同轴通道结构示意图；（d）3D打印制作的对准器结构示意图；（e）同轴通道实物图。QuanPLEX为融智生物科技（青岛）有限公司生产的微流控PCR平台。

在前期研究中，林建涵教授团队已研究开发了2种同轴通道，并应用于食源性致病菌的免疫磁分离(Wang等, 2017; Huang等, 2018)；然而，它们存在一些局限性，例如磁场分布不均匀或不能释放纳米磁珠。此外，它们需要更多的孵育时间才能保证抗体和抗原之间的特异结合。因为核酸可以利用静电相互作用而在所有方向上与MSB进行结合，因此MSB对核酸的吸附在理论上需要较少的时间，这说明这种同轴通道设计在DNA提取方面会比在免疫磁分离方面具有更大的优势。因此，林建涵教授团队利用改进的同轴通道进行DNA提取，并利用微流控PCR进行DNA扩增和检测，开发一种快速、灵敏的大肠杆菌O157：H7检测方法。在这项研究中，首先将二氧化硅磁珠泵入同轴通道，通过高梯度圆环磁场将磁珠均匀地捕获在同轴通道中；然后，泵入大肠杆菌O157：H7的裂解液，通过磁珠将DNA捕获在通道中，再利用乙醇洗涤除去残留的蛋白质，并利用少量去离子水洗脱，得到纯化和浓缩的DNA；最后，利用微流控PCR扩增和测定获得的DNA。当使用大体积（10mL）细菌样品时，这种细菌检测方法能够检测到低至12 cfu/mL的大肠杆菌，加标牛奶样品中大肠杆菌O157：H7的回收率为97.4％至100.6％。

这种细菌检测方法在检测大体积样品中低浓度大肠杆菌O157：H7中表现出巨大潜力，将传统的细菌分子生物学检测技术的灵敏度提高了近百倍。林建涵教授团队研究中所用的微流控核酸定量分析平台是融智生物QuanPLEX食品安全微生物快速检测系统。QuanPLEX是一款符合国标的食品微生物快检系统，可同时检测32个指标；检测速度快，比传统qPCR检测速度提高一倍以上；安全性好，封闭式芯片可避免气溶胶污染；极简前处理，一键式操作软件，操作简便。QuanPLEX有望实现食源性致病菌的现场、快速、多目标检测，切实保障食品安全。