抗抑郁药物临床机制研究-膜蛋白免纯化互作检测

方案标题：抗抑郁药物临床机制研究-膜蛋白免纯化互作检测

检测样品：脑胆固醇（CHOL）与神经营养酪氨酸激酶受体2 (TRKB)

检测项目：在细胞裂解液中检测膜蛋白与小分子互作

应用领域： 制药

方案摘要：

使用MST技术检测跨膜蛋白TRKB与脑胆固醇和抗抑郁药物的结合。其中跨膜蛋白TRKB并未纯化，直接将过表达GFP-TRKB的HEK293T细胞裂解后取上清。以GFP-TRKB融合蛋白作为荧光信号源，进行MST检测。

方案详情: 

抗抑郁药物（AD）结合到靶点上进而产生临床抗抑郁效果的机制尚不清晰。赫尔辛基大学研究人员发现脑胆固醇（CHOL）可直接与神经营养酪氨酸激酶受体2 (TRKB) 跨膜域(TMD)结合，进而调节TRKB信号通路。此外，发现典型和快速作用的抗抑郁药直接结合到TRKB TMD二聚体形成的一个位点上，从而促进TRKB细胞表面表达，增强脑源性神经营养因子（BDNF）信号传导。该研究解决了关于抗抑郁药临床疗效的基础分子机制问题。

在此研究中，作者使用MST技术检测TRKB与CHOL和ADs的结合。TRKB为跨膜蛋白，且分子量较大92kD，很难纯化。作者将GFP-TRKB质粒转染至HEK293T中过表达。进行互作亲和力检测时，直接将过表达GFP-TRKB的HEK293T细胞裂解后取上清。以GFP-TRKB融合蛋白作为荧光信号源，进行MST检测。

向HEK293T细胞裂解液中加入梯度稀释的CHOL，通过MST技术检测到CHOL与GFP-TRKB的亲和力为~20μM。表明CHOL可直接与TRKB结合，突变TRKB 433位关键氨基酸破坏了TRKB与CHOL之间的相互作用。

图1：TRKB与CHOL直接相互作用

抗抑郁药结合TRKB跨膜结构域
MST结果显示了抗抑郁药氟西汀（FLX）和GFP标记的TRKB在HEK293T细胞裂解液中的直接相互作用。

图2 FLX结合TRKB跨膜结构域