消除溶剂水吸收峰干扰的红外光谱测量新方法

许多生物分子只有在水溶液中才具有活性,脱水后不仅其生物活性发生很大变化,它们的结构也会发生某些变化。因此,活性生物分子的研究中,溶剂水具有不可替代性。水是强极性分子,在3400和1640cm-1区域出现宽且强的红外吸收谱带,水的吸收带常与感兴趣的生物分子吸收谱带发生重叠或部分重叠,致使生物分子的红外光谱研究复杂化和高度困难。在早期的红外教科书中常常说“红外光谱不适合于水溶液或含水物质的分析”,说明了水峰干扰的严重性。许多实际工作中,为得到感兴趣物质的高质量红外光谱,水的红外吸收峰(干扰峰)必须扣除掉。

去掉水吸收谱带的方法之一是用氘代水(D2O)替代水(H2O)作溶剂。由于同位素效应,D2O与H2O的红外谱带位置明显不同。然而,许多生物分子中存在活性氢(—COOH,—NH2等),活性氢(H)与D2O中的氘(D)可发生交换反应。通常,为确保交换反应进行完全,D2O溶液必须放置足够长的时间或者进行多次溶解过程。氢氘交换会导致某些红外吸收带发生移动,甚至导致生物分子的局部构象发生变化。更为严重的是,由于蛋白质在D2O中的结构将有可能不同于其在H2O中的结构,观察蛋白质在水(H2O)溶液中的结构信息和对其生理活性的研究也将缺乏实际意义。

除了用D2O溶剂,差谱技术(spectralsubtraction)也被广泛用来扣除水峰的干扰。该技术通过对溶液的红外吸光率谱As和溶剂水(或含水参比溶液)的吸光率谱Aw进行光谱差减,得到扣除了水吸收峰干扰的谱图。尽管这方面的研究已经开展多年,并且目前也已成为获得水溶液红外光谱的主要手段,但差谱技术在光谱的重现性、偏差的不确定性等方面还存在改善空间。

测量红外光谱时,通常要分别获得待测样品的单光束谱(样品单光束谱)和参比样品的单光谱谱(背景单光束谱),两者的比值为待测样品的透过率谱。根据朗伯-比尔定律,如果水在背景谱和样品谱中完全相同,则水的吸收峰就不会出现在最终的红外光谱图上。但是,控制水在参比样品和待测样品中的数量一致是很困难的。衰减全反射(ATR)附件是目前获得水溶液红外光谱的常规方法。但是,到目前为止,利用ATR测量技术达成在参比样品和待测样品中水的有效分子总数一致是一项几乎不可能的任务。

测量红外光谱时,先测量溶液(K2CO3溶液或BSA溶液)的样品单光束谱,再测量参比样品的背景单光束谱。不同于传统的测量方法,采集背景谱时采用了双背景样品。先扫描空的ATR晶体N次(N要足够大),暂停,ATR晶体上注满参比溶液(15%NaCl溶液或纯水),继续扫描,观察红外光谱图,可以看到水的吸收峰由强→弱→消失全过程,获得满意的无水吸收峰干扰的红外光谱时终止扫描。实验路线框图见图1。

纯水的红外光谱与溶液中水的红外光谱可能有些不同,包括谱带位置,吸收峰的形状等。因此,制备参比样品时,要求参比样品中水的状态与待测样品中水的状态尽量一致。纯水与10%BSA溶液中水的红外光谱基本一致,因此,此情形下采用纯水作为参比样品。但10%碳酸钾溶液中的水与纯水的红外光谱不同。根据报道,水在碳酸钾氯化钠混合盐溶液中与水在氯化钠盐溶液中的红外光谱非常类似,因此,10%碳酸钾溶液情形下,选用15%氯化钠溶液作参比样品。

用单次ATR附件测量时,如果以空锗晶体为参比样品,以10%碳酸钾溶液为待测样品,则水在1640cm-1处的吸收峰强度大约为0.075(吸光率)。如果以15%氯化钠溶液作参比样品,同样以10%碳酸钾溶液作待测溶液,则在1640cm-1处出现负的但强度很小的水吸收峰。这是因为与15%氯化钠溶液相比,10%碳酸钾溶液含水量更少。吸收峰很小的原因是两溶液含水量尽管有差异,但差异很小。

分别用不同的参比样品(空锗晶体或氯化钠溶液),水的吸收峰(碳酸钾溶液)有正有负。那么,在测量背景谱时,先用空白的锗晶体作参比样品,扫描多次后,暂停,然后将15%氯化钠溶液填加到锗晶体上,再继续扫描,随着扫描次数增加,会出现什么情况呢?

图2是实验结果。1643cm-1为水的吸收峰,1400cm-1为碳酸根(CO23+)的吸收峰。实验中,首先测量了待测样品10%K2CO3水溶液的样品单光束谱,然后按照上面的叙述先用空白锗晶体作参比样品,扫描20次背景谱(空白锗晶体)后,暂停。得到图2a,这时,水的吸收峰(1643cm-1)为正值。在1,2,…,20次扫描累加中,碳酸根和水的吸收峰强度保持不变。暂停后,换上15%氯化钠水溶液参比样品,接着继续扫描背景谱。增加新的扫描次数,碳酸根的吸收强度继续保持不变(因15%氯化钠溶液不含碳酸根)。但每增加一次新扫描,水的吸收就会稍稍减弱些(15%氯化钠溶液含水量大于10%碳酸钾溶液)。当对氯化钠溶液扫描达到48次时,1643cm-1处水峰已明显变小,如图2b所示。每增加一次对氯化钠水溶液的扫描,水的吸收峰都会变得更小。到扫描次数达到300次时,水的吸收峰完全消失,这时停止扫描就获得了令人满意的无水吸收峰干扰的红外光谱,见图2c。实验中没有采用差谱技术操作。因此,实际测量时,纵坐标可以采用吸光率,反射率或透光率等单位。

图2c是采用ATR技术直接获得不含水干扰峰的红外光谱。需要强调的是,两参比样品的扫描顺序对获得红外光谱的质量有重要影响。空白锗晶体(含水0)与10%碳酸钾溶液含水量差异较大,而15%氯化钠溶液与10%碳酸钾溶液含水量差异很小。因此空白锗晶体作为第一顺位的参比样品,先行扫描,这样,水的IR峰表现出较大吸收峰,如图2a。容易理解,第2阶段,强的水吸收峰逐渐变小可以得到理想的扣除效果。如果15%氯化钠溶液为第一顺位参比样品,则出现的水吸收峰(负)很小但还不能小到忽略不计。第2阶段,弱小的吸收峰变消失的过程(时间短暂)不利于观察。对第一顺位参比样品(空白锗晶体)的扫描次数(N)也不能太少,扫描次数N越大,扣除效果越好,但也需要更多的累加时间。为得到满意的信噪比,第一顺位参比样品的扫描次数宜控制在20~32次之间。第二顺位参比样品的实际扫描次数M必须根据被扣除水峰的强度变化来实时选择。原则是水干扰峰信号可忽略不计时,停止扫描。

为评判新方法扣除水峰的效果,我们与传统的差谱技术结果进行了对比。以空白锗晶体作参比样品,分别测量了10%碳酸钾和15%氯化钠溶液的红外光谱。选择合适的差减因子,将两溶液的红外光谱进行差减,得到图3a。

从图3比较得出,新采用的双参比样品方法(图3b)效果更好,其信噪比有显著提高,尤其在1640cm-1区间效果更明显。双参比样品还有一优点就是操作简便,可根据需要实时监控。在单次ATR附件中,双参比样品方法成功扣除了水的干扰,取得了很好的效果。

双参比样品(空白锗晶体+水),背景谱含有水和空气的信息。而所需要的背景谱是适宜厚度水层的信息。只有双参比样品的单光束谱与水的单光束谱高度相似时,双参比方法才能取得好的效果。下面讨论该方法的局限。

图4为利用双样品法获得的红外光谱。参比样品均为空气,待测样品分别为聚苯乙烯(PS)(图4a)或双样品(聚苯乙烯+空气)。图4a为PS薄膜的红外光谱,图4b,c,d,e为双样品(聚苯乙烯+空气)的红外光谱。与图4a比较,图4b,c,d和e中的谱图都明显失真。即图4b,c,d和e中的谱不能代表PS的红外光谱。空气与聚苯乙烯双样品的红外光谱与纯聚苯乙烯的红外光谱何条件下才能高度相似呢?

将图4中2000~1640cm-1区域放大,得到图5。从图5b,c,d和e中的谱峰与a中相对应的谱峰比较,强度不同,但峰型失真不明显。2000~1640cm-1区域无强吸收峰,对红外光的吸收小。因此,红外峰的吸光率是影响失真的重要因素。越弱的吸收峰,即吸光率A越小,失真程度越小。越强的吸收,见图4中带星号吸收带,失真越严重。

容易想象,影响失真的另一因素是双样品中真实物质(PS)信号在最终的光谱中所占的比例。对PS扫描M次,对空气扫描N次,总共(N+M)次扫描。N等于零时,等于PS的谱,不失真。M等于零时,得到空气的光谱,以PS谱作判断标准,失真最严重。可以用M/(N+M)来判断失真情况,该数值等于最大值1时,不失真。M/(N+M)数值越大(越接近于1),得到累加谱的失真程度越小。

图6给出了水的ATR谱,水和空气的混合ATR谱。图6中所有谱图测量时参比样品均为空白Ge晶体,即锗晶体表面不加任何样品,背景谱累积扫描32次。图6a为水的ATR谱,采集水样品64次。从图6a中,发现在单次ATR附件测量中,水最强峰3400cm-1处的吸光率约为0.3,在1640cm-1处吸光率约为0.075。图6b,c和d中样品谱采集时分别扫描水样品若干次外加扫描空ATR晶体若干次,因此,图6b,c和d中的ATR谱均为双样品(水+空气)混合光谱。

混合谱图6b和6a(纯水ATR谱)峰型高度相似,两者的差减结果(图6f)也说明了这一点。图6b中M/(N+M)=48/（16+48）=0.75,也就是说,单次ATR附件测量时,只要M/(N+M)大于0.75,则得到的混合谱都不存在明显失真,可用于获得高质量的扣除水干扰的红外光谱测量。混合谱图6d，M/(N+M)=0.25与水的谱图6a比较,存在明显失真,因此图6a与图6d差减结果远离理想的直线,见图6h。实际测量中,对于单次ATR附件,只要参比溶液(例15%NaCl溶液)含水量稍稍多于待测溶液(10%碳酸钾溶液)含水量,计算表明,采用此新方法都可以获得无水峰干扰的高质量红外光谱。