RNA m5C修饰的生物学及在肿瘤发生和免疫治疗中的作用

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2022年4月1日，《Biomark Res》杂志发表了题为“Biological roles of RNA m5C modification and its implications in Cancer immunotherapy”的综述文章，综述了RNA m5C甲基化修饰的生物学作用及其在癌症免疫治疗中的潜在机制。

期刊：Biomarker Research

日期：2022.04.01

IF：8.633

摘要

表观遗传学（包括DNA修饰和RNA修饰）一直是后基因组时代生命科学的热点领域。自首次发现m6A在mRNA中广泛存在，至今已发现160-170种RNA修饰。这些甲基化发生在不同RNA类型中，分布具有物种特异性。5-甲基胞嘧啶（m5C）已在各种物种的代表性生物mRNA、rRNA和tRNA中被发现。作为一种可逆的表观遗传修饰，RNA m5C修饰影响修饰后的RNA分子命运，并在各种生物过程中发挥重要作用，包括RNA稳定性调控、蛋白结合和转录调控。此外，众多研究证据也表明RNA m5C在肿瘤发生中的作用。本文回顾了m5C修饰生物学作用的最新进展，如何被writers、readers、erasers蛋白调控，以及肿瘤发生和癌症免疫治疗的潜在分子机制。

RNA 5-甲基胞嘧啶 (m5C) 修饰概述

DNA和RNA修饰在各种生物过程中起着重要作用，RNA修饰包括N6-甲基腺苷（m6A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）和7-甲基鸟苷酸（m7G）等约170种。RNA修饰通过作用于RNA的三级结构、生物发生、定位和功能来增加RNA种类的复杂性。在这些修饰中，mRNA N6甲基腺苷（m6A）参与翻译、miRNA生物合成和基因衰减（图1）。

图1：mRNA甲基化分布，mRNA甲基化位置

20世纪70年代，研究人员发现m5C修饰。来自供体的活性甲基（通常为S-腺苷甲硫氨酸(SAM)）被添加到RNA中胞嘧啶碱基的碳5位置以形成m5C修饰，是在mRNA（messenger RNA）和ncRNA（non-coding RNA）中检测到的广泛RNA修饰，ncRNA包括tRNA、rRNA、lncRNA、snRNA、miRNA、eRNA。许多物种中报道了m5C修饰，但其分布有所不同，如真核tRNA和mRNA比细菌mRNA和tRNA具有更多的m5C修饰。

tRNA m5C可以维持稳态、优化密码子-反密码子配对、调节应激反应、调控翻译效率和准确性。rRNA m5C修饰与神经胶质瘤对应激相关酶NQO1的生物活性底物的敏感性以及应激下的rRNA-tRNA-mRNA三级复合体的结构稳定性相关。20世纪70年代，研究人员首次发现真核mRNA m5C修饰，如仓鼠细胞mRNA和某些病毒RNA。后来将HeLa细胞的全转录本进行亚硫酸盐测序，发现了mRNA和ncRNA中广泛分布的m5C修饰。mRNA m5C修饰与多种生物学过程有关，如mRNA稳定、剪接和核质穿梭，DNA损伤修复，扩散和迁移，干细胞发育、分化和重编程。mRNA m5C修饰异常通常与多种疾病的病因有关，包括动脉硬化、自身免疫性疾病和癌症。

mRNA 中的m5C修饰

随着高通量测序技术的发展和液相色谱技术灵敏度的提高， RNA甲基化整体水平的鉴定方法得到了极大发展。液相色谱-质谱（LC-MS/MS）使用基于液相质谱的串联质谱，能够获得分子和碎片离子peaks，可以对碱基进行定性和定量分析。而重亚硫酸盐测序是一种使用甲基化分析DNA不同区域的方法。在亚硫酸盐测序中，亚硫酸盐处理可以将基因组中的未甲基化C碱基转化为U，在PCR扩增后变为T，以区别于具有甲基化修饰的原始C碱基，结合高通量测序技术，可以绘制具有单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。此外，最近开发了一种新的物种特异性计算方法Staem5，用于准确预测小鼠和拟南芥中的RNA m5C位点。

亚硫酸盐测序表明m5C修饰是另一种丰富的mRNA修饰，可能是另一种RNA表观遗传标记。增强LC-MS表明真核生物确实表现出内胞嘧啶的甲基化和羟甲基化。由于LC-MS中m5C修饰位置信息丢失，RNA重亚硫酸盐测序（RNA-BS）为RNA单碱基分辨率绘制m5C图谱开辟新的可能。Lukas Trixl和Alexandra Lusser使用这种方法发现约10000个位点（>20%甲基化）并比对到约8500个mRNA上，所有已测序C的m5C率为0.43%，他们还发表了首个人类细胞的胞嘧啶甲基化组。

最近，Amort等人在小鼠胚胎干细胞中检测到约7500个m5C位点（> 20%甲基化），比对到1650个mRNA上，结果显示与小鼠脑中486个mRNA的2075个m5C位点对应。结果表明m5C修饰主要位于编码区，并在翻译起始位点周围富集。另一项研究发现m5C修饰主要位于mRNA转录本的非翻译区（UTR）。

另一篇关于HeLa细胞和小鼠胞嘧啶的文章发现，在HeLa细胞中约2000个基因中鉴定了约3600个位点，在不同小鼠组织中鉴定了2500-4400个位点（1000-1655个基因）。通过亚硫酸盐测序检测到拟南芥mRNA中约100个m5C位点。另一项研究利用MeRIP-seq发现4465个表达基因的6045个peaks。MeRIP-seq还用于检测古细菌Sulfolobus solfataricus和芽殖酵母的m5C水平，分别发现酵母中的单位点mRNA和S.solfataricus中14个m5C修饰mRNA。

m5C在mRNA中的功能研究目前并不全面和深入，但也有一些有趣的发现，如Yang等人证明斑马鱼的母体-合子转变（MZT）期间，RNA m5C修饰调控母体mRNA稳定，突出了m5C mRNA修饰在早期发育中的关键作用。

ncRNA中的m5C修饰

m5C不仅调节mRNA稳定性，还调节rRNA和tRNA的稳定性。大量研究表明m5C修饰对于tRNA和rRNA的翻译调控至关重要。

大多数关于m5C修饰的研究都集中在tRNA上。tRNA甲基化最常发生在可变环和T-stem连接区域的胞嘧啶及47-50位点的1-3个C上。它们参与二级结构组成，与tRNA密码子鉴定和稳定性有关。tRNA甲基化主要影响小鼠的蛋白结合。一些研究表明C48甲基化可以增强碱基疏水性并促进碱基堆积以稳定互作。C48和D环上的核苷15形成 “Levitt pair”，从而成为特征性L形三维结构。除C48外，C38是反密码子环中另一个频繁甲基化位点。研究表明小鼠tRNA-Asp中C38甲基化可促进多个Asp蛋白翻译，在天门冬氨酸密码子解码过程中，tRNA-Met的m5C38丢失导致翻译保真度降低。同时DNMT2介导的m5C38 tRNA-Asp可以区分同源和近同源密码子，如不同的tRNA-Asp和tRNA-glu可以避免氨基酸的假阳性率，提高翻译准确性。tRNA-Thr和tRNA-Cys转录后，CCA序列在3'端添加，随后C72甲基化。其他线粒体研究表明，tRNA-Met的m5C34导致线粒体f5C修饰，在解码非常规AUA密码子时，它作为蛋氨酸在线粒体翻译中发挥关键作用。酵母tRNA-Leu中m5C34的摆动与翻译调节有关。在氧化应激反应中，其甲基化水平显著增加，可以增强uug密码子富集的mRNA翻译，如核糖体蛋白El22A。此外，NSUN2介导的tRNA m5C48和m5C49位于V-loop（VL）和T-stem-loop（TSL）的连接序列中，这对于促进tRNA稳定性和蛋白翻译非常重要（图2）。

图2：tRNA中m5C功能

rRNA核糖体功能关键区域的m5Cs修饰有助于保持其构象稳定。如果穹窿体RNA中不存在胞嘧啶-5甲基化，会异常加工成与Argonaute相关的小RNA片段，这些小RNA片段功能与miRNA类似。m5C位于lncRNA的X-非活性特异性转录本（XIST），可以防止PRC2(Polycomb repressing complex 2)复合体在体外结合。Hu等人研究了结直肠癌5hmC在lncRNA中的分布和调控，发现hm5C分布在lncRNA中，并与lncRNA转录呈正相关。研究证实，hm5C通过hm5C修饰的超级增强子和启动子异常活性直接或间接调控失调的结直肠癌lncRNA。此外，hm5C还参与lncRNA位点的长染色质互作，且不同hm5C标记物调控的lncRNAs与不同的临床结果和肿瘤状态相关。

m5C作为一种RNA修饰，具有较为丰富且高度动态的特性，构成了应对不断变化的内外环境的多功能有效机制，通过调节细胞内RNA代谢和相关功能发挥作用。m5C修饰正日益成为表观转录组学领域的主流。

m5C “writers”、“erasers” 、“readers”的动态调控

m5C修饰主要由甲基转移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和识别蛋白（readers）3种蛋白介导。RNA中的m5C由NOL1/NOP2/SUN（NSUN）蛋白家族招募，包括NSUN1-7和DNA甲基转移酶（DNMT）同源物DNMT2、NSUN1、NSUN2和NSUN5在真核生物中低表达，NSUN3、NSUN4、NSUN6和NSUN7在真核生物中高表达（图3）。

图3：m5C的writer和eraser蛋白

m5C writers

m5C甲基转移酶（RCMTs）以腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶形成m5C。RCMT称为催化m5C甲基化的“writers”，包括NSU甲基转移酶和DNMT2。现已发现超过10种RNA m5C甲基转移酶，包括DNMT2和tRNA特异性甲基转移酶（TRDMT）家族成员、NOL1/NOP2/SUN结构域（NSUN）家族成员。其中，NSUN甲基转移酶包括NSUN1~NSUN7和NSUN5a/b/c。TRDMT家族包括拟南芥中的TRM4A和TRM4B。NSUN和DNMT家族酶都具有保守的motif IV和motif VI，DNMT2和NSUN2具有互补的目标特异性。

m5C erasers

去甲基化酶蛋白“erasers”(如TET酶家族)，通过介导添加的（written）RNA去甲基化可逆。近年LC-MS/MS/MS定量分析表明，TET具有作为RNA去甲基化酶的潜力，其过表达可显著增加HEK293T细胞RNA 5hmC水平。TET（ten-eleven translocation）蛋白TET1、TET2和TET3作为DNA双加氧酶起作用，催化DNA上的5mC至5hmC。RNA中5fC到5caC的氧化由TET1介导。TET2介导m5C氧化可能抑制5-甲基胞嘧啶对真核生物中双链RNA形成的影响。TET2催化RNA 5hmC，可能导致RNA降解。这些研究表明5hmC在转录后调控中起关键作用。此外，线粒体DNA和RNA双加氧酶α-酮戊二酸依赖性双加氧酶ABH1（ALKBH1）也参与m1A沿细胞质tRNA去甲基化，表明ALKBH1 RNA m5C代谢在调控线粒体活性方面具有巨大潜力。此外，ALKBH1还可以特异性作用于组蛋白加氧酶组蛋白H2A。

m5C readers

RNA修饰的大部分生物学功能与识别蛋白有关。RNA m5C识别蛋白，如ALYREF和YBX1，通过识别和结合m5C位点发挥生物学作用。m5C修饰的RNA单核苷酸pull-down结合质谱分析已应用于多种m5C mRNA，并鉴定m5C mRNA的ALYREF和YBX1两种识别蛋白。

总之，m5C修饰通过与多种“writers”、“erasers” 、“readers”蛋白互作广泛影响基因表达（图4）。因此，m5C的动态修饰在各种生物学过程中发挥作用，包括胚胎干细胞自我更新和分化、昼夜节律、热休克、DNA损伤反应和性别决定。

图4：m5C “writers”、“erasers” 、“readers”功能。由NSUN家族蛋白（NSUN2、NSUN3、NSUN4、NSUN5、NSUN6）、NOP2、DNMT2和ALKBH1调控的tRNA或rRNA中的m5C修饰影响翻译。由NSUN2、YBX1、AlyREF和TET家族蛋白调控的lncRNA、miRNA、vtRNA和mRNA的m5C修饰影响其稳定性和出核。

癌症中的异常m5C

m5C的整体修饰及其调节因子，包括“writers”、“erasers” 、“readers”，在各种类型的癌症中异常表达。新的证据表明甲基化状态与癌症发病机制密切相关，包括肿瘤发生、转移、进展以及耐药性和复发（图5）。

图5：mRNA、miRNA和lncRNA中的异常m5C沉积促进肿瘤血管生成和转移抑制。NSUN2介导的tRNA m5C修饰调节癌症干细胞分化。NOP2对rRNA m5C上调或NSUN5下调干扰癌细胞增殖和细胞周期。

在各种癌症中发现m5C writers蛋白、erasers蛋白、readers蛋白（图6，表1）。

图6：m5C writers蛋白、erasers蛋白、readers蛋白的异常表达在各种癌症类型中的作用。NSCLC非小细胞肺癌；BRC乳腺癌；AML急性髓系白血病；BLC膀胱癌；GBM胶质母细胞瘤；GC胃癌；GNC妇科肿瘤；CRC结直肠癌；HCC肝细胞癌；PRC前列腺癌。

HDFs人二倍体成纤维细胞；U87人胶质瘤细胞系U87；ATX Autotaxin

表1：m5C在癌症中的作用及机制

m5C和癌症免疫治疗

30年前首次提出使用基因的进行蛋白替代疗法概念。然而由于RNA分子的不稳定和可诱导免疫原性，这种方法未能传播。后来Kariko团队将m5C单独或联合纳入mRNA治疗，并降低了toll样受体（TLR）介导的mRNA免疫作用，标志着RNA和免疫治疗领域的突破，即mRNA碱基修饰改变了免疫活性。Andries等人认为，由于m5C修饰的mRNA可通过抑制TLR3逃逸先天免疫系统，因此m5C mRNA可以作为mRNA治疗新方法（图7）。

图7：m5C在免疫系统调节中的鉴定功能

m5C对肿瘤免疫微环境的影响

越来越多生物信息学分析证据表明m5C在肿瘤免疫微环境中的重要性，多个甲基化调节因子可以作为癌症预后和诊断标志物。m5C调节因子表达水平较高的口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者在DC、NK细胞和CD8+T细胞等TIL中免疫活性较低。m5C评分低的乳头状甲状腺癌（PTC）患者静息的CD4+T细胞和CD8+T细胞较高，预后较好；而m5C评分高的患者中活性NK细胞和单核细胞富集，预后较差。三阴性乳腺癌(TNBC)m5C RNA甲基化调节因子表达变化、NSUN2表达上调和NSUN6表达下调，可以客观预测TNBC患者的临床预后风险，可能成为TNBC的新预后标记，为了解TNBC的RNA表观遗传修饰提供线索。相关研究也证实，NSUN3和NSUN4可以预测肺鳞癌的预后并调节免疫微环境。肺腺癌患者不同的m5C模式具有不同的TME免疫细胞浸润，高m5C评分组预后更好。此外m5C调控的lncRNA还可以预测肺腺癌患者的总生存率并影响肿瘤免疫微环境。胰腺癌患者中，3个m5C相关lncRNA显示出预后价值。TIDE（肿瘤免疫功能障碍和排除）算法结果显示高m5C-lncRNA评分对免疫治疗有更好的反应。胰腺导管腺癌（PDAC）另一项研究评估了m5C相关lncRNA与PDAC浸润免疫细胞之间的关系：Naïve B细胞，CD8+T细胞、Treg细胞和静息的NK细胞在低风险组中表达水平较高，而M0和M2表型巨噬细胞在高风险组中表达水平较高，表明m5C相关lncRNA可能通过促进PDAC中M2表型巨噬细胞极化或浸润来调节胰腺癌进展。在头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、乳腺癌、高级别浆液性卵巢癌、皮肤黑色素瘤、结肠癌的研究中也存在相关表达。

癌症免疫治疗调控中的m5C writers

免疫逃逸是癌症的标志，T细胞耗竭（exhaustion）是肿瘤免疫逃逸的主要原因。NSUN2是一种通过增加m5C甲基化来修饰tRNA和mRNA 的tRNA甲基转移酶，是维持干细胞自我更新和分化的重要因素。头颈鳞癌（HNSCC）中无论HPV状态如何，NSUN2表达和T细胞活化的组合都与患者生存率相关，表明NSUN2可作为免疫检查点阻断的潜在生物标志物。另据研究报道，NSUN2甲基化ICAM-1(Intercellular Adhesion Molecule 1)mRNA促进其翻译，从而抑制M2巨噬细胞极化并抑制肿瘤转移（图7）。此外，靶向NSUN2表达也可改善HNSCC免疫治疗的结果，当然，需要更大样本量验证NSUN2如何影响免疫检查点阻断结果。

癌症免疫治疗调控中的m5C readers

YBX1蛋白是最常见的肿瘤相关抗原，诱导T细胞应答，因此可以作为效应免疫靶点和评估的候选疫苗。化疗诱导肿瘤中的免疫抑制微环境并通过YBX1介导的PD-L1（programmed death-1 ligand 1）上调诱导免疫逃逸（图7）。YBX1在化疗耐药的HCC细胞中上调，YBX1敲除通过阻断PD-L1表达和激活肿瘤微环境中的T细胞来逆转化疗耐药。功能性细胞毒性CD8+T细胞上调、髓源性抑制细胞和调节性T细胞下调与克服肿瘤免疫抑制环境和免疫逃逸状态相关。YBX1促进肿瘤免疫抑制微环境和免疫逃逸通路中的信号转导。此外，YBX1敲除可通过阻断PD-L1表达和激活肿瘤微环境中的T细胞逆转HCC耐药性。Tao等人提供的数据表明，通过靶向YBX1信号级联反应可以逆转肿瘤免疫逃逸和多药耐药性，表明这是一种针对肿瘤化疗耐药的有效治疗方案。

以上这些数据表明m5C调节因子的调控可能是一种在肿瘤免疫治疗中的有用策略。

结论和观点

RNA m5C修饰是调控真核生物基因表达的新分子机制，m5C修饰如何影响ncRNA的生物发生、定位和功能，以及这些影响如何与癌症的病因学相关联有待阐明。近年来人们致力于研究癌症中m5C修饰，本篇综述重点关注的是writer-NSUN2，eraser-TET系列和reader-YBX1。

一些概念验证研究表明，小分子抑制剂靶点失调的m5C调节因子具有治疗癌症的潜力。截至目前尚未开发出m5C抑制剂。但在DNA甲基化中，最初开发用于靶向这些蛋白的化学药物，如地西他滨（5-aza-2-deoxycytidine,decitabine) 和阿扎胞苷 (5-azacytidine,Vidaza）已被FDA批准用于治疗骨髓增生异常综合征，但在实体瘤的治疗应用有限。

RNA m5C修饰的生物信息学研究对于鉴定单分子测序中的m5C位点和预测不同RNA物种的m5C位点也至关重要。几种机器学习算法已被开发用于预测智人（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）的m5C位点，随着计算方法的快速发展，m5C表观转录组学将被充分理解并揭示与癌症的关系。

未来，RNA m5C在免疫系统调控和肿瘤免疫微环境中的具体作用将是重要的研究方向。RNA m6A的writer、reader和eraser耗竭在细胞对感染的反应和免疫细胞类型中具有显著的表型结果。RNA m5C是否在免疫系统中发挥类似功能值得深入研究。更重要的是，不同的RNA修饰如何在免疫调节中相互对抗或结合，还需要很长的路去探索。

RNA m5C修饰部分酶相同，如DNMT1和DNA m5C。这种共享机制可能在肿瘤发展和进展过程中发挥重要作用。m5C可以与肿瘤细胞和免疫微环境共同作用来阻碍或促进肿瘤发生。m5C在肿瘤微环境中的免疫检查点分子靶点鉴定，可以将靶向治疗可以与检查点免疫治疗结合治疗癌症。总之，对癌症m5C表观遗传修饰研究不仅将为癌症生物学和免疫应答的分子机制提供新的见解，还将为开发新的有希望的疗法铺平道路。

参考文献：Song H, et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in Cancer immunotherapy. Biomark Res. 2022 Apr 1;10(1):15. pii: 10.1186/s40364-022-00362-8.