易基因ChIP-seq助力于揭示HIV-1感染细胞转录抑制因子Schlafen 5的表观遗传调控机制

易基因细胞转录抑制因子ChIP-seq研究成果见刊《Nucleic Acids Research》

2022年6月10日，中国医学科学院药物生物技术研究所丁寄葳副研究员为第一作者、岑山和李晓宇为共同通讯作者的研究团队以“Schlafen 5 suppresses human immunodeficiency virus type 1 transcription by commandeering cellular epigenetic machinery”为题在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）杂志发表研究论文。该研究以细胞为研究对象，通过ChIP-seq等分析结果揭示了SLFN5的细胞表观遗传调控机制。

标题：Schlafen 5 suppresses human immunodeficiency virus type 1 transcription by commandeering cellular epigenetic machinery

时间：2022-06-10

期刊：Nucleic Acids Research

影响因子：IF 19.16

技术平台：ChIP-seq、ChIP-qPCR、Co-IP、EMSA等

摘要：

Schlafen-5（SLFN5）是一种干扰素诱导的Schlafen家族蛋白，参与免疫反应和肿瘤发生。然而目前对其抗HIV-1（human immunodeficiency virus type 1 transcription）功能知之甚少。在本研究中，作者鉴定出SLFN5的过表达抑制了HIV-1的复制并降低病毒mRNA水平，而内源性SLFN5缺失则促进HIV-1复制。此外，染色质免疫沉淀 (ChIP-seq+ChIP-qPCR)检测结果表明SLFN5通过与U5-R区域的两个序列结合，显著降低HIV-1长末端重复序列（LTR）的转录活性，从而抑制RNA聚合酶II（RNA PoL II）向转录起始位点募集。诱变研究验证了核定位序列和N-末端1-570氨基酸片段在抑制HIV-1中的重要性。进一步机制研究表明，SLFN5与PRC2复合物、G9a和组蛋白H3的成分互作，从而促进H3K27me2和H3K27me3修饰，导致HIV-1转录沉默。且SLFN5阻断了潜伏期HIV-1激活。总之，本研究结果表明，SLFN5是通过表观遗传调控的HIV-1转录抑制因子，是HIV-1潜伏期的潜在决定因素。

图形摘要：SLFN5抑制HIV-1 LTR转录模型

材料和方法：

结果：

（1）SLFN5 抑制 HIV-1 的复制和病毒蛋白的表达

为了解SLFN5的潜在抗病毒活性，作者用HIV-1 DNA NL4-3luc.RE-和 VSV-G 以及表达 SLFN5 的载体或对照载体 (pcDNA4) 转染HEK293T细胞。通过感染SupT1细胞，然后检测荧光素酶活性来确定培养上清液中 VSVG psedotyped NL4-3luc.RE 衍生病毒 (HIV^NL4-3luc ) 的水平。

图1：外源性SLFN5抑制HIV-1复制和Gag表达

为确定内源性SLFN5是否具有抗HIV-1活性，作者使用SLFN5短发夹RNA（shRNA）来产生SLFN5不表达的稳定HeLa细胞系（HeLa-SLFN5 KD）和稳定表达加扰shRNA（HeLa Ctrl）的对照细胞系。然后用HIV^NL4-3luc报告病毒感染HeLa-SLFN5 KD和HeLa-Ctrl。

图2：内源性SLFN5抑制HIV-1复制

（2）N-末端结构域（NTD）和核定位序列（NLS）决定SLFN5的抗HIV-1活性

为定义SLFN5抗HIV-1活性的结构域，作者在N端和C端构建了7个SLFN5编码序列片段，分别命名为SLFN5-dC1（1-780aa），SLFN5-dC2（1-570aa），SLFN5-dC3（1-335aa），SLFN5-dN1（150-891aa），SLFN5-dN2（335-891aa），SLFN5-dN3（450-891aa）和SLFN5-dN4（660-891aa）。结果没有一个构建体显示出用野生型SLFN5观察到的抗HIV-1活性。于是作者鉴定了SLFN5的抗病毒活性是否需要核定位序列，证明了核定位序列在SLFN5抑制HIV-1中的重要性。

图3：N-末端结构域和NLS许可SLFN5抑制 HIV-1

（3）SLFN5与HIV-1 LTR结合并抑制LTR驱动的基因表达

鉴于SLFN5的核定位对其抗HIV-1活性至关重要，作者试图确定SLFN5是否抑制HIV-1转录。使用萤火虫荧光素酶报告基因构建体pGL3-LTR（包含上游的HIV-1 LTR序列），以确定SLFN5对LTR驱动的转录影响。作者将此报道质粒与SLFN5或对照载体一起转染到HEK293T细胞中以测试SLFN5是否抑制LTR启动子。

图4：SLFN5通过N-末端结构域特异性结合LTR来抑制基础转录和Tat反式激活HIV-1转录

（4）ChIP揭示SLFN5通过N-末端结构域与HIV-1 U5-R区域结合

据报道，SLFN5在N-末端含有一个DNA结合结构域，这增加了SLFN5通过直接结合抑制HIV LTR启动子的可能性。为验证这一假设，作者使用转染了SLFN5-Myc和NL4-3luc.RE-DNA的HEK293T细胞进行染色质免疫沉淀(ChIP)测定（ChIP-seq和ChIP-qPCR）。

图5：SLFN5通过与U5-R区域结合抑制HIV-1 LTR转录并减少RNA PoL II募集

A． HIV-1基因组示意图。黑线表示B中ChIP-qPCR每对引物的位置。

B． 用NL4-3luc转染HEK293T细胞，然后进行ChIP-seq和ChIP-qPCR。

C． HIV-1 LTR及其指示突变。5′LTR分为U3、R和U5区域。

D． 将pGL3 LTR、pGL3-d614–624、pGL3-d614–624/523–534或pGL3-d614–624TAR与SLFN5或对照载体一起瞬时转染HEK293T细胞。48小时后检测荧光素酶活性。

E． 使用表达SLFN5的核提取物（SLFN5 NEs）、对照核提取物（pcDNA4 NEs）和表达dN2的核提取物（dN2）进行EMSA分析。

F． 用 NL4-3luc.RE- 和SLFN5 DNA或对照载体转染HEK293T细胞，然后进行 ChIP 检测。

G+H． VSV-G-模型NL4-3luc.RE-报告病毒感染HeLa细胞，然后进行ChIP检测。

I． 用0、2、4μg SLFN5-Myc和4μg NL4-3luc.RE-或HIV-2 LTR转染HEK293T细胞。转染后48小时，对细胞进行ChIP检测。

（5）co-IP揭示SLFN5通过募集组蛋白甲基转移酶增加U5-R的抑制性表观遗传标记

为进一步研究SLFN5如何抑制HIV-1 LTR转录，作者进行co-IP和免疫印迹，证实了SLFN5与RBBP7和组蛋白H3的结合。为此，作者测试SLFN5是否改变HIV-1 LTR中的抑制性染色质标记。使用H3K27me2或H3K27me3抗体的ChIP-qPCR实验结果表明，与对照组相比，SLFN5使HIV-1 R-U5区域中的H3K27me2和H3K27me3标记分别增加了1.5倍和2倍。为进一步确定哪种甲基转移酶参与此过程，作者用NL4-3luc.RE-转染HEK293T细胞和SLFN5以及靶向这些甲基转移酶中的每一个的siRNA，检测已知与H3K27me修饰相关的六种组蛋白甲基转移酶，包括Suv39H1/2，G9a/GLP和EZH1/2。数据结果表明，SLFN5通过募集组蛋白甲基转移酶在HIV-1 LTR上沉积抑制性表观遗传标记。

图6：SLFN5 通过沉积H3K27me2和H3K27me3标记并与组蛋白H3互作和修饰复合物来抑制HIV-1转录

（6）SLFN5在HIV潜伏期阻止SAHA和JQ-1激活

此前研究报道，G9a或EZH2的药理学抑制已被证明可重新激活潜伏期的HIV-1，因此作者研究了SLFN5是否在HIV-1潜伏期中发挥作用。数据结果表明SLFN5有助于维持HIV-1潜伏期。

图7：SLFN5破坏潜伏性病毒的激活

结论：

在这项研究中，研究人员发现SLFN5有效抑制HIV-1 LTR定向转录，并在不同程度上抑制不同的HIV-1毒株。机制研究表明，SLFN5靶向HIV-1 LTR、LTR 614-624和TAR中两个不连续但紧密相连的序列，并阻止RNA Pol II与LTR启动子结合。进一步发现SLFN5通过募集G9a和PRC2组蛋白甲基转移酶复合物将H3K27抑制标记物沉积在HIV-1 LTR上。最后，研究人员发现 SLFN5 在两个潜伏感染的细胞模型中抑制了JQ-1 对 HIV 潜伏期的重新激活。研究结果表明，SLFN5 是一种新型的HIV-1转录抑制因子，并通过表观遗传调控维持 HIV 潜伏期。

参考文献：

Jiwei Ding, et al. Schlafen 5 suppresses human immunodeficiency virus type 1 transcription by commandeering cellular epigenetic machinery, Nucleic Acids Research, Volume 50, Issue 11, 24 June 2022, Pages 6137–6153