「青莲百奥聚焦」研究癌细胞表面新生抗原，免疫多肽组学是这么做的

今日带您了解如何利用免疫多肽组学技术，研究结直肠癌细胞的表面新生抗原，揭示了免疫治疗所面临的挑战。
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研究背景
免疫检查点抑制因子(ICIs)在微卫星不稳定性(MSI)结直肠癌中是非常有效的，但在微卫星稳定性(MSS)结肠癌中是无效的。新生抗原是人类白细胞抗原（HLA）结合肽，它们被认为是使T细胞将肿瘤细胞识别为异源的关键底物。

2019年11月18日，伦敦癌症研究所和瑞士洛桑路德维希癌症研究所的研究人员发表在J ImmunoTherapy Cancer上文章“Immunopeptidomics of colorectal cancer organoids reveals a sparse HLA class I neoantigen landscape and no increase in neoantigens with interferon or MEK-inhibitor treatment”，首次成功利用基于质谱的免疫多肽组学技术直接测量了微卫星稳定性CRCs患者衍生的类器官(Patient derived organoids,PDOs)癌细胞表面的新生抗原。同时，他们还用IFN-γ和靶向药物曲美替尼对PDOs进行了处理，以测试能否增加癌细胞表面新生抗原的数量。


技术路线

结果速递
5名CRCs患者PDOs的免疫多肽组学检测结果
研究人员开发一种新的CRCs患者PDOs培养方法使细胞扩增至几亿的规模，足以进行深入的免疫肽分析。对5名CRCs患者PDOs未经处理的细胞样本纯化HLA多肽并进行质谱分析。质谱鉴定到的HLA Ⅰ的独有肽段平均数为9936，但他们之间鉴定到的肽段数差异较大（图1A,B），通过流式细胞仪分析结果表明细胞表面HLA分子的数量会影响免疫肽组的复杂性（图1C）。接下来评估了共享HLA等位基因的PDOs之间肽表达上的重叠（图1D），HLA-II质谱结果中CRC-01、CRC-03和CRC-05检测到6-24个独有肽段，CRC-04和CRC-08分别鉴定了392个独有肽和713个独有肽。

图1：五种PDOs中HLA-I免疫肽组分析

新生抗原的鉴定   蛋白质组学
研究人员通过质谱方法检测体细胞突变编码的新生抗原，分析了5名结直肠癌患者的PDOs，从中发现了可能产生新生抗原的612个基因突变。然而，他们仅仅检测到了3个新生抗原（图2A，B），远低于计算机预测的结果。同时研究了肿瘤/睾丸抗原在HLA-I、 II 的表达，结果发现只有2个PDOs有这些基因编码的肽。分别在CRC-01上鉴定了一个源自FAM46D的肽，CRC-08上鉴定到一个源自SPANXN3的肽，这两个肽都在HLA-I上检测到，HLA-II上未检出肿瘤/睾丸抗原。

图2：五种PDOs中检测和预测的新生抗原

IFN-γ和曲美替尼对免疫多肽组的影响
IFN-γ处理其中4个PDOs，每个细胞表面HLA-I表达量均有所增加，同时增加了所有PDOs上HLA-II上肽的鉴定数量，所有PDOs中的IFNγ调控基因的表达也大大增加（图3A，B）。MS结果显示通过IFNγ处理后平均1371个肽上调，1169个肽下调。IFNγ诱导基因中平均有119个肽显著上调，而有13个肽下调。
曲美替尼处理PDOs可有效阻断下游效应器ERK的磷酸化，但并不完全增加HLA-I肽鉴定数量（图3C，D），对HLA-II呈递的肽数量具有可变影响，在两个PDOs中增加，而在另外两个PDOs中减少。尽管前期研究表明，IFN-γ和曲美替尼可以增加新生抗原的表达，但在该研究中并没有发现这种效果。

图3：IFNγ和曲美替尼处理后免疫多肽组的变化


总结       糖基化蛋白质组学

综上所述，通过体外类器官培养扩增，能够很好的解决质谱分析免疫多肽组学对样本量的需求。结果发现晚期结直肠癌细胞表面的新生抗原比计算机预测的要少得多，这也解释了当前免疫疗法对大多数晚期结直肠癌疗效不佳的原因。这一发现揭示了免疫治疗所面临的挑战，但同时也为个性化肿瘤疫苗的研制铺平了道路。

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结直肠癌类器官的免疫肽组学显示 HLA I类新生抗原景观，在干扰素或MEK 抑制剂治疗下新生抗原没有增加