「青莲百奥」重磅升级|TMT标记定量蛋白质组告别“搭桥”省时省力省钱

TMT标记定量蛋白质组学可以表征生物系统中的全部蛋白质，目前已成为解决重要生物学问题的重要工具。然而，基于其技术方面的一些局限，目前仍面临一定的挑战，主要包括分析速度、蛋白质组覆盖深度和定量的质量。

糖基化蛋白质组学

TMTpro 16plex标记试剂是Thermo Fisher Scientific新推出的新一代串联质谱标签，可实现一次标记16个样本，既能提升多重样品数量，又保证了蛋白检测高通量和定量质量。以往TMT通量是标记11个样本，但如果您的实验设计是4组3重复，4组4重复或是5组3重复，那么该如何进行实验设计？下面我们以4组3重复为例可采取如下方案：

方案1：分成3个标记组，并且增加3个内标“搭桥”，即增加3个混样内标的标记上机。

A1、B1、C1、D1、内标

A2、B2、C2、D2、内标

A3、B3、C3、D3、内标

该方法需要3次质谱检测，即降低了检测速度同时又增加了检测成本。

方案2：分成2个标记组，将一组样本随机分散在不同标记组中。 

A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2

C3、D1、D2、D3  

这种方法增加了数据重复性差的风险，并且也需要2次质谱检测。

然而有了TMTpro 16plex这一切都不是问题，4组3重复？5组3重复？一次统统搞定，省时省力省钱！！！OMG，选它！选它！！选它！！！

2020年3月来自哈佛大学Steven P. Gygi研究组在Nature Methods上发表的题为“TMTpro reagents: a set of isobaric labeling mass tags enables simultaneous proteome-wide measurements across 16 samples”的研究论文，该文介绍了新一代串联质谱标签试剂TMTpro，既能提高样品标记数量（它可实现一次同时标记16个样品），又能保证蛋白鉴定高通量及质量，可有效解决上述存在的挑战。下面让我们具体来看一下TMTpro究竟具有哪些提升。

TMTpro试剂：一组同量异位标记质量标签，可同时对16个样品进行蛋白质组范围的测定

作者首先利用人类细胞裂解物对TMTpro试剂和TMT试剂的蛋白定量能力进行了测试，TMTpro标记鉴定到的肽段数比TMT试剂略少，但TMTpro所需的碎裂能量更低，产生的报告离子信号更强。对于其他指标，包括标记效率、m/z的分布、MS2离子注入时间，SEQUEST得分、质量误差和鉴定肽段的长度，二者之间基本相同。

为了研究TMTpro试剂和TMT试剂的定量精度，作者进一步利用SPS-MS3和hrMS2方法比较了HCT116细胞和293T细胞之间的蛋白质表达差异。研究发现二者具有高度相似的定量性能，并表现出很好的相关性。

图1 TMT试剂和TMTpro试剂标记样品的比较

作者使用TMTpro 16plex标记的样品组研究使用和不使用Torin1处理的八种人类细胞系的蛋白差异表达情况，并结合实时搜索（RTS）方法，在每个重复平均定量了8800个蛋白质（每个蛋白质7.5个肽的平均值），整个蛋白质组分析的总数据采集时间为18 h，每个蛋白质组的分析时间仅为1.1 h。

图2 TMTpro试剂在用Torin1处理的八种人类细胞系中的应用

作者一式五份用DMSO、1和20 µM星形孢菌素（一种广谱激酶抑制剂）处理HCT116细胞裂解物，并进行了PISA分析。在常规TMT 10plex实验中，需要以对照组作为实验之间的桥梁来进行两次TMT 10plex实验。而使用TMTpro 试剂，可以在一个15plex实验中容纳对照组和两个浓度组，从而减少了50％的处理和数据采集时间，并且在各个浓度下基本没有缺失值。

图3 TMTpro试剂在二维PISA分析中的应用

TMTpro试剂代表了进一步改进蛋白质组学中样品多重化的强大起点。其中有几个值得注意的优点：（1）蛋白质组检测深度显著，通过分馏分从细胞或组织中检测蛋白通常超过8000个；（2）稳定的同位素标记直接支持多重化，同时提供高度准确的相对定量；（3）统计推断可以在整个系统中得到更大的应用；（4）可以适用更复杂的实验设计（例如可以在一个TMTpro实验中安排更多数量的处理和重复实验）。总之，新一代TMTpro将推动定量蛋白质组学技术达到前所未有的高通量和覆盖深度。

TMTpro 16plex标签同常规的TMT 6标、10标一样，由三部分组成：分子量报告子、分子量标准化部分和反应基团。TMTpro 16plex试剂通过反应基团能够高效地标记酶解后的肽段。在一级质谱图中，分子量标准化部分使任何一种TMTpro 16plex试剂标记的不同样本中的同一肽段表现为相同的质荷比。在串联质谱中，可剪切臂能够优先断裂以便释放分子量报告子。每个报告子都有各自独特的分子量，并且能够在MS/MS分析中反应出所标记的多肽的样品丰度，根据报告离子的信号强度值可获得样品间相同肽段的定量信息，再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。

TMTpro 16plex标签结构示意图