「青莲客户文献」基于活性和富集的宏蛋白质组学对牛瘤胃微生物群活性脲酶的洞察

发布时间： 2023-08-24 11:10 来源：北京青莲百奥生物科技有限公司

详细介绍：

在瘤胃中，微生物脲酶在尿素代谢中起着至关重要的作用，适当调节脲酶活性有助于提高尿素的利用效率，减少对环境的氮排放。处理瘤胃微生物群的复杂性和瘤胃微生物脲酶的多样性，确定优势脲酶作为调控目标非常重要。酶活性是评价酶催化性能的重要指标，脲酶活性高的微生物脲酶可能是提高尿素利用效率的理想调控靶点。作者提出了一种通过基于活性筛选结合宏蛋白质组学（青莲百奥提供技术支持）鉴定从复杂瘤胃中发现具有高脲酶活性的微生物脲酶方法。

标题：Activity- and Enrichment-Based Metaproteomics Insights into Active Urease from the Rumen Microbiota of Cattle.

期刊：International journal of molecular sciences (IF =6.208)

时间：2022.01

背景

调节微生物脲酶活性对于提高尿素利用效率和减少反刍动物对环境的氮排放具有至关重要的作用。处理微生物脲酶的多样性，确定高活性脲酶为目标是关键。

常规使用培养依赖性方法从相关环境样品中分离和选择目标酶，但因大量未培养微生物的存在，目前瘤胃中活性脲酶的鉴定受到限制。

文章重点

作者介绍了一种基于活性脲酶蛋白质提取和富集的宏蛋白质组学分析方法（青莲百奥提供技术支持）来从牛瘤胃微生物群中发现高活性脲酶。

研究思路

（公众号回复关键词“726研究思路”获得高清原图）

研究内容

1、瘤胃微生物群中活性蛋白的提取

作者专注于具有脲酶活性的蛋白质，为了选择较佳的蛋白质提取方法，采用六种蛋白质提取方法（超声、珠子研磨、冷冻研磨、高压、冻融和蛋白质提取试剂盒）用于获得具有高脲酶活性的蛋白质。在所有方案中，超声波处理、低温研磨和高压产生了更多的氨产量（图1B),其中超声处理和高压获得了更高的蛋白质浓度(图1A），但脲酶活性较低（图1C）。在脲酶活性水平上，冷冻研磨方案表现佳，冷冻研磨4 min时脲酶活性高。此外，在高压压力方法的三个压力中，1000 MPa 压力产生的蛋白质浓度、氨产量和脲酶活性高。理想的活性蛋白提取方法不仅要生产出具有高脲酶活性的蛋白，而且要获得更高的蛋白提取率。作者将脲酶活性高的方法（冷冻研磨 4 min）与较高蛋白质浓度和产氨的方法（超声处理，高压压力 1000 MPa）相结合设计4种组合方法：4 min + 112.5 W（样品经过冷冻研磨 4 min，然后使用 112.5 W 的振幅进行超声处理）、4 min + 137.5 W、4 min + 162.5 W和 4 min + 1000 MPa（样品经过低温研磨 4 min，然后使用 1000 MPa 的高压压力处理）。结果表明使用组合方法获得了更高的蛋白质浓度和氨产量（图1D,E），但联合方法的脲酶活性比冷冻研磨 4 分钟至少低 40.37%（图1F）。这些结果表明，无论是否使用组合方法，冷冻研磨 4 分钟都是比其他提取方法更好的高脲酶活性蛋白质提取方法。

2、高活性脲酶的富集

采用凝胶过滤层析分离冷冻研磨（4 min）提取的瘤胃微生物粗蛋白。纯化色谱图显示在图 2A，其中在x轴中显示了总共 12 个馏分。两个主要峰分别包括馏分 1-7 和 8-10。使用 SDS-PAGE 分析 12 个馏分的蛋白质分布（图 2B）。馏分 1、2、11 或 12 中几乎没有蛋白质条带。主要条带出现在馏分 4-10 的 40-55 kDa 中。从馏分 7 开始，在 55-70 kDa 处出现了一条微弱的条带，正好在脲酶的分子量范围内。馏分 8-10 中 55-70 kDa 的蛋白质条带更清晰，表明脲酶可能集中在馏分 8-10 中。进一步测定这 12 个馏分的脲酶活性。所有馏分均显示脲酶活性（图 2C)，较高的脲酶活性出现在馏分 8-10 中，证实了脲酶集中在馏分 8-10 中的假设。作者选择了酶活性高的馏分 9 进行宏蛋白质组学分析，其中仅从馏分 9 中分离出 55 到 70 kDa 之间的单个主要条带，以大限度地减少杂蛋白的影响。

3、瘤胃微生物活性脲酶的鉴定

理想的蛋白质数据库应包含样品中可能表达的完整蛋白质。作者构建了一个瘤胃微生物群的宏基因组衍生蛋白质数据库，其中总共生成了 52.15 ± 6.71 Gb 的原始碱基和 2,272,147 个非冗余蛋白质序列。针对定制的蛋白质数据库对上述提取纯化的馏分 9 进行宏蛋白质组学分析（青莲百奥提供技术支持）。总共鉴定了 6905 个肽段、2225 个蛋白质和 1493 个蛋白质组。即使经过前期的优化富集在具有高脲酶活性的部分中鉴定目标条带，蛋白质组成仍很复杂。2225 种蛋白质中有 6 种被鉴定为脲酶（图 3A)，并且脲酶 Lc1 出现在样品 1、样品 2 和样品 3 中。根据 BLASTp 分析，Lc1 与 Fibrobacter sp. 的同一性百分比高，为 94.1 %。（图 3B）。此外，系统发育树的结果显示Lc1与已知脲酶之间的系统发育关系较远，表明Lc1可能是未分类的脲酶。其他五种已鉴定的蛋白质（M1、M2、M3、M4 和 M5）被归类为一个蛋白质组，与Treponema sp.的同一性百分比高。

4、已鉴定瘤胃微生物脲酶与已知脲酶的比较分析

活性位点和瓣区与脲酶活性密切相关。作者比对来自瘤胃微生物、克雷伯菌、幽门螺杆菌、Cajanus cajan、巴斯德孢子菌和小肠结肠炎耶尔森菌的脲酶的氨基酸序列 (图 4A）。这些在脲酶活性位点处和附近的残基得到了很好的保护，特别是在已鉴定的瘤胃微生物脲酶（Lc1、M1、M2、M3、M4 和 M5）中。对于脲酶的瓣区，这些残基在两个α-螺旋中是严格保守的，并且Lc1、M1、M2、M3、M4和M5的脲酶中α-螺旋的氨基酸序列相同，但这些残基在β-转角中不保守。考虑到 M1、M2、M3、M4 和 M5 的脲酶被归类为蛋白质组，作者选择其中一种脲酶 M3 来创建同源模型。在这些已知的脲酶（Ka、Hp、Cc、Sp和Ye），选择与Lc1和M3的β-转角序列高度相似的那些进行进一步的结构比较。Lc1、M3、Ka和Hp的 3D 蛋白质结构显示在图 4B. Lc1和M3蛋白结构的带状图几乎重叠（粉色线和玫瑰红色线），Lc1和M3的β-转角位置与Ka和Hp的位置明显不同（图 4C）。因此，活性位点的这些残基和两个α-螺旋是保守的，而β-转角中的这些残基是非保守的，这一发现可用于影响瓣区的柔韧性和脲酶活性。

总结：

在研究中，作者提出了一种通过针对牛瘤胃微生物群的基于活性的筛选和富集来确定微生物脲酶的简单方法。使用两步活性筛选方法来得到具有高脲酶活性的理想馏分，其中冷冻研磨结合蛋白质纯化有助于提取具有更高脲酶活性的蛋白。为了大限度地减少杂蛋白的影响，通过 SDS-PAGE 分离具有高脲酶活性的部分，结合质谱法研究SDS-PAGE 分离后的凝胶条带。通过对宏基因组衍生的蛋白质数据库进行数据库搜索，鉴定出六种脲酶。此外，使用同源性建模显示了鉴定的脲酶的 3D 蛋白质结构。