诚信认证:
工商注册信息已核实!样本策略:雷公藤甲素处理48 h后的CRC细胞系HCT116及对照组(n=3)
技术策略:TMT定量蛋白组、TMT磷酸化蛋白组
图1:实验思路
通过TMT标记蛋白组技术共定性到5860蛋白质,其中962个蛋白有差异表达:经雷公藤甲素的处理后,其中403个蛋白水平表达上调,559个蛋白水平表达下调(图2B)。共鉴定出3410个磷酸化蛋白及17056个磷酸位点,与对照组相比,经雷公藤甲素处理的细胞组中鉴定出了3110个具有较高磷酸化水平的蛋白和3161个具有较低磷酸化水平的蛋白,且大多数差异表达的蛋白及磷酸化的蛋白定位于细胞核和细胞质(图2C,2E)。 图2:蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学全局分析 通过对差异蛋白的结构域富集分析包括植物同源结构域(PHD)-finger;富含亮氨酸重复序列(leucine rich repeat,LRR);染色质组织修饰剂(染色质);MCM2/3/5家族;类表皮生长因子等(图3A)。KEGG通路分析结果上调蛋白富集的通路有化学致癌作用、胆汁分泌、补体和凝血级联途径、前列腺癌和药物代谢细胞色素P450。下调蛋白富集的通路有PPAR信号通路、粘蛋白型O-聚糖生物合成、淀粉和蔗糖代谢、刺猬信号通路等(图3B)。接下来,研究人员又预测了差异蛋白之间的相互作用,之后确定了四个重要的分子复合物检测(MCODE)模块(图3D-G)。之后确定出7个蛋白为枢纽蛋白:IMP3、BYSL、PDCD11、PNO1、NSA2、RRS1和RPF2。 图3:差异表达蛋白之间的相互作用分析 差异磷酸化的蛋白富集的结构域有蛋白激酶、RNA识别基序、WD、PDZ、 LIM、植物同源结构域(PHD)-finger等(图4A)。KEGG通路富集的结果有癌症中的蛋白多糖、人类免疫缺陷病毒1型感染、调节肌动蛋白细胞骨架、AMPK信号等(图4B)。通过相互作用分析确定了5个关键模块(图4D-H)且其中8种蛋白作为枢纽磷酸化蛋白:SRSF1、HNRNPC 、NCBP1、HNRNPA1、DHX9、DDX5、RBM25和SF3B1。 图4:差异表达磷酸化蛋白之间的相互作用分析
此外,研究人员进一步对差异表达的磷酸化蛋白序列分析,与对照组相比,发现雷公藤甲素处理组中一些基序被上调,一些基序被下调,基于motif评分,研究人员终确定了差异的前6个枢纽基序并确定了几种可能有助于介导雷公藤甲素对结直肠癌的作用的激酶。通过分子对接进一步验证表明雷公藤甲素对AMP1、IMP3、HNRNPC和DHX9具有良好的结合活性。