研究策略
样本策略：
发现结合蛋白：用LNCaP细胞核裂解液进行4次重复TPP、SPROX实验并筛选结合蛋白；
验证结合蛋白：用LNCaP细胞核裂解液进行RNA pull down并LC-MS/MS分析。
技术手段：TPP、SPROX、RNA-protein pull down-LC-MS/MS、圆二色谱、蛋白质印迹（WB）
文章摘要
用SPROX和TPP方法研究三种不同结构（一级、二级和三级）的RNA及其对LNCaP细胞核裂解液中蛋白质折叠稳定性的影响；
用传统的pull down实验与TPP、SPROX实验结果对比，对蛋白检测情况进行分析；
用WB-TPP进行验证已知的RNA-蛋白质互作关系。
图 本研究工作流
结果速递
一、SPROX和TPP分析
在本研究中，使用图1所示的实验工作流程，在存在和不存在三种RNA配体的情况下，对LNCaP细胞核裂解液中的蛋白质进行SPROX和TPP的系列实验。结果发现，在TPP中测定的蛋白质的70%以上可以在SPROX分析中测定，只有SPROX中测定的32%的蛋白在TPP中测定（图2）。对于TPP，温度设置在37到64°C之间，SPROX，变性剂尿素浓度设置为0到5.5 M之间。由于这些不同结合实验中的溶液条件可能会改变RNA的折叠，并且热量和尿素会诱导不同的RNA构象变化，致使在SPROX和TPP实验中观察到的大量独有蛋白。文章用TH RNA配体处理的样本进行了圆二色谱（CD）实验来探索温度和尿素的变性条件引起的构象变化（图3），结果显示通过不同温度点、尿素浓度点CD信号的改变，TPP中所用的热量可能会诱导显著的TH去折叠，进而改变与蛋白质靶标的结合。
图1：TPP和SPROX工作流（左）；三种RNA配体结构（右上）；SPROX和TPP技术获得的蛋白质组覆盖率（右下）
图2：TPP和SPROX两种实验模式下检测的蛋白重叠情况
图3：圆二色谱
二、pull down实验、TPP、SPROX实验结果对比
作者进行了常规的RNA-蛋白质下拉实验，用3′-去硫生物素化的TH RNA配体和LNCaP细胞核裂解液中的蛋白质进行了共孵育，将该方法结果与上述两种实验进行对比。TH下拉实验中确定的108个蛋白质中，约有15%与TPP和SPROX确定的命中重叠（图4B）。在SPROX实验中发现了最多的重叠（10个蛋白质SPROX:下拉，4个蛋白质TPP:下拉）。如上所述，TPP和下拉实验之间的这种有限重叠可能是由于下拉方法中使用的温度（4°C）比TPP更低。然而，同样值得注意的是，ILF3和HNRNPA1在所有三种方法中都被采样并确定为命中。如上所述，这两种蛋白质是已知的TH结合物。
图4：三种检测结果的overlap
三、富集分析
将实验中检测到的蛋白进行了富集分析，发现TH、PolyU和SL蛋白命中在RNA结合蛋白中最显著（图5A）。另外还富集在与RNA相关的其他分子功能上，如异源和有机环状化合物结合和核酸结合，富集分析的结果提供了证据，证明SPROX和TPP可以鉴定三级、二级和一级RNA结构的RNA结合蛋白。使用UniProt ID映射软件和PFam数据库，作者还研究了SPROX映射中含蛋氨酸的肽命中到其各自蛋白质内先前注释的结构域的一致性。在TH的74个蛋白质带有注释的结构域(RNA-binding domains (RBDs))，这74种蛋白质由98个含蛋氨酸的肽命中表示，其中66个含甲硫氨酸的肽中有49个被定位到已知的RBD，这表明TH RNA和这些蛋白质相互作用体具有新的相互作用表面。这些定位的RNA结合结构域包括RNA识别基序（RRM）（21肽）、解旋酶结构域（7肽）、双链RNA结合基序（DRBM）（5肽）和其他RBD（16肽），包括SAP结构域、58个S4 RNA结合结构区、59个和NTF2结构域60（图5B）。将同样的分析应用于PolyU配体命中，130个含蛋氨酸的肽命中产生了31个肽，这些肽映射到17种不同蛋白RBDs，包括HuR中的RBD。
在SPROX和TPP实验的共有蛋白中，15种蛋白质中有5种具有沉积在PDB中的3D结构，其中蛋白质的结构域与RNA复合，并且RNA结合界面被解析。其中包括来自TH实验的HNRNPC/C1、HNRNPA1和ILF3、来自PolyU实验的HuR以及来自SL实验的SRSF1。在检查这些结构时，发现所有映射的肽都位于RNA结合位点附近。虽然受到可用结构的限制，但该分析验证了SPROX从参与特定结构RNA识别的RBD中鉴定肽的倾向。这也表明SPROX不仅可以用于鉴定新的RNA结合蛋白，还可以用于鉴定新型RBD。
图5：富集分析及蛋白结构域分析
四、WB-TPP分析
作者利用WB-TPP工作流程来证实在TPP-MS实验中检测到的选定的RNA-蛋白质结合相互作用。这些实验对HuR和TH、PolyU和SL、PABP1和Sam68与TH配体进行的WB分析，且WB 与TPP结果保持一致。另外使用WB-TPP来表征METTL16与三种测试配体的结合，METTL16在TPP或SPROX实验中没有得到有效的测定，METTL16在TH下拉实验中被检测为命中。Pull down的一个优点是，在亲和选择步骤中，可以有效地浓缩测试样品中以低丰度存在的潜在命中蛋白（即本工作中的核裂解物），最终使它们更容易在自下而上的蛋白质组学读数中检测到，因为它们的离子信号不太可能被测试样品中的其他蛋白质掩盖。WB-TPP方法的一个优点是，来自较不丰富蛋白质的信号不会被测试样品中较丰富蛋白质的那些信号掩盖。
研究结论
基于亲和力的pull down和稳定性方法（TPP和SPROX）都有助于在蛋白质组规模上识别强烈的、直接的RNA-蛋白质相互作用，只是基于稳定性的方法更具有优势，因为不需要特别标记的RNA，能提供间接相互作用的信息，如RNA处理后蛋白质组内可能发生的蛋白质-蛋白质相互作用和构象改变等。这些方法有可能为靶向特定RNA-蛋白质交互作用的小分子疗法的发展提供见解。
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