AAV病毒包装

                       腺相关病毒(AAV)是一种人细小病毒，目前因为能作为一种基因治疗载体而受到广泛关注。构建重组AAV(rAAV)涉及到用一个目的基因替换病毒基因组的大部分，然后将这个重组基因组包装到一个有感染性的病毒颗粒里。
腺相关病毒（AAV）载体
1.广泛用于体内实验研究（定点注射与整体注射）
2.表达稳定高效；非整合，转基因安全性高
3.CMV, EF1a, CAG，GBG, Syn 等启动子可选
4.EGFP、mCherry等荧光蛋白可选
腺相关病毒（AAV）干扰载体
1.广泛用于体内实验研究（定点注射与整体注射）
2.表达稳定高效；非整合，转基因安全性高
3.构建快捷，序列保证准确
4.标记基因可采用EF1a或GBG启动子表达，稳定高效
腺相关病毒包装与纯化
5.腺相关病毒包装采用三质粒系统进行包装，共转染后通过对细胞裂解物进行密度梯度离心纯化和收集病毒。
腺相关病毒滴度检测
腺相关病毒感染细胞
1.检测方法：定量PCR检测病毒基因组中的外源DNA拷贝数
2.对于特定细胞有较高的感染率，如心肌和血管内皮细胞
3.实验原理：腺相关病毒的基因组为单链DNA
4.感染温和，表达稳定长效
腺相关病毒定位注射
5.感染范围广，可以用于神经系统、眼睛、心肌、肝脏、肌肉和肺部定位注射或定向给药
6.滴度高，颗粒小，扩散能力强
7.表达稳定，可持续半年以上
8.外源基因定向重组，免疫原性低，极少发生非特异反应和免疫抑制，适合于进行基因治疗研究
rAAV定位注射脑皮层区域进行基因沉默
Nature medicine, 2013, 19(6): 773-777.
中枢神经AAV注射
rAAV定位注射纹状体进行基因沉默
PloS one, 2013, 8(6): e64637.
立体定位注射 12 周龄SD 雄性大鼠实验前麻醉。注射时， 将27 号针头用26 号内径的塑料管和10μl 汉米尔顿注射器（由微量注射泵推动）连接在一起，每分钟注入病毒0.2μl，每次3μl。定位海马的坐标是前囟后3.6mm，侧向2.0mm，背向2.8mm。每当针头定位后或是准备拔出前都停留1min。
视网膜下AAV 注射
小鼠用3%异氟醚麻醉，用30 号注射针在接近晶状体的巩膜上切开一个小口，通过这个小孔，用5μl 汉密尔顿注射器（连接微量进样装置）将2μl AAV 病毒缓慢（20-30s内）注入视网膜下。动物选择P21以后的小鼠。从病毒注射到后期实验中间至少休息3个星期。需要进行行为学实验的，两只眼睛都要感染相同的病毒。
整体注射
整体注射是最接近临床治疗方式的实验方法。一般地，利用病毒进行整体注射主要通过胚胎注射、肌肉注射和静脉注射等方式。实验研究发现，对于大部分病毒而言，在动物的肝脏、肾脏和胰脏积累较多；或者通过缺血再灌注等方式，也可以实现心脏的病毒感染。而rAAV病毒作为一种细小病毒，颗粒小，免疫原性低，已经广泛用于整体实验并获得了积极的效果，成为整体实验研究中日趋突出的病毒工具。
病毒的整体注射对病毒滴度和体积有较为严格的要求，滴度低的病毒会造成感染和表达减弱甚至根本无法感染；滴度过高或杂质过多的病毒会引起免疫反应造成动物死亡。作为免疫原性最低的AAV病毒载体，其在不同组织中的感染活性与血清型有着密切关系。其滴度范围一般在1012v.g./ml以上。一般认为，为了增强在某一组织中的表达，采用组织特异启动子可以达到更好的效果。
rAAV整体注射肝脏感染效果

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