几种热点重组蛋白药物的异质性检测

重组蛋白药物是用基因重组技术，获得连接有可以翻译成目的蛋白基因片段的重组载体，将其转入可以表达目的蛋白的宿主细胞从而表达特定的重组蛋白分子，用于弥补机体由于先天基因缺陷或后天疾病等造成的体内相应功能蛋白的缺失。

重组蛋白药物主要包括细胞因子、激素、酶、融合蛋白等，由于重组蛋白药物生产工艺的复杂性及结构的相对不稳定性，终产品中的目的蛋白常常不以单一的形式存在，在性质上存在不均一性，这种异质性对于重组蛋白类药物的溶解性、稳定性、免疫原性、体内外生物活性、药物动力学发挥着关键影响，因此选择合适的方式进行检测至关重要。

促红细胞生成素

促红细胞生成素（EPO）是一种由肾脏自然生成对红细胞的刺激性激素，也是首批商业化治疗贫血的重组糖蛋白之一。EPO在主要蛋白序列的N端和O端有复杂的糖基化修饰，因此EPO存在多种电荷异构体。1999年，欧洲药典首次明确使用毛细管区带电泳CZE的方法进行EPO不同电荷分布异构体的定量检测。随后，世界各地的制药公司、政府机构和学术界的合作研究改进了这一方法，并开发了EPO系统适应性的标准。

SCIEX 的毛细管电泳PA 800 Plus制药分析系统，通过毛细管两端轨道的移动完成换液，可以完成毛细管凝胶电泳CGE、区带电泳CZE、等点聚焦电泳cIEF等多种电泳模式，灵活地进行各类生物药的异质性检测及分析。对于EPO可进行符合中国药典和欧洲药典的cIEF&CZE电荷异构体检测。

SCIEX 毛细管电泳PA 800 Plus制药分析系统

欧洲药典EPO参考标准品PA 800 Plus CZE电泳图

毛细管区带电泳CZE的方法耗时较长，仅分离就需要60 min，而使用PA 800 Plus 则可以通过更换分离缓冲液及电泳模式，完成EPO的快速电荷异质性检测。采用快速CZE方法分离只需36min，而中国药典的cIEF方法只需30min。

EPO的快速CZE检测电泳图谱

EPO的cIEF检测电泳图谱

重组人生长激素

重组人生长激素（hGH）是由大肠杆菌或是酵母菌表达的一种重要的非糖基化蛋白质激素，由191个氨基酸组成的蛋白，蛋白分子量为22 kDa。临床上，主要用于治疗内源性生长激素缺乏而导致的儿童期生长障碍和成年期生长激素缺乏症。2006年1月，基于多个实验室的联合验证，欧洲药典使用CZE的方法进行生长激素电荷相关杂质的控制，并证实了CZE方法具有更高的灵敏度和重现性。

PA 800 Plus可以使用欧洲药典的CZE方法完成生长激素的电荷异质性检测，并且在欧洲药典及美国药典的标准品上得到了验证。电泳图谱与欧洲药典标准品的描述相匹配，包括：在主峰前后均有两个明显的异构体峰；其中，P2为裂解形式，P3为Gln-18突变，P4为脱酰胺形式，洗脱为双峰，均是异构体的关键杂质。

美国药典（红色曲线）和

欧洲药典hGH标准品（蓝色曲线）

在PA 800 Plus上进行的CZE检测的电泳图谱

重组人干扰素α2b

重组人干扰素为全球第二大重组蛋白药物，其中重组人干扰素α2b（IFN-α2b）是一种重要的免疫相关蛋白，主要用于治疗病毒性疾病和肿瘤，如乙型肝炎、带状疱疹毛细胞白血病等。

IFN-α2b是一种165个氨基酸的单链多肽，分子量为19.26 kDa，一般是采用分子排阻色谱法及凝胶电泳来控制原液中的纯度。SCIEX 开发了利用LC/Q-TOF在其完整蛋白的水平及多肽水平对其异构体进行检测的方案。

对四个IFN-α2b样品进行LC/Q-TOF分子量的检测，根据理论与实际检测出的分子量差异，推算出的相关的翻译后修饰情况。

IFN-α2b样本的去卷积质谱图

为了进一步分析分子异质性，用胰蛋白酶消化IFN-α2b样品，在肽段水平上进行分析，可以发现，样本4E（蓝峰）存在+Met及乙酰化的异构体。

IFN-α2b样本的肽图

SCIEX 2021年最新推出的高分辨质谱ZenoTOF™ 7600系统可以完成重组蛋白药物的结构表征。该系统拥有Zeno™ trap(Zeno 阱)和电子活化解离(EAD)碎片技术；Zeno trap克服了正交TOF技术在传统上占空比挑战，可以提升二级碎片高达20倍的灵敏度；可调节的EAD碎裂技术，确保可以从不同的化合物类型中获得新颖的结构信息并进行定量定性。

高分辨质谱ZenoTOF™ 7600系统

Etanercept 依那西普

依那西普是一种结合肿瘤坏死因子 (TNF) 的二聚体融合蛋白，为 TNF 抑制剂。Etanercept 竞争性地抑制 TNF-α 和 TNF-β 与细胞表面 TNF 受体的结合，使肿瘤坏死因子在生物学上失去活性。依那西普主要用于风湿性关节炎、幼年特发性关节炎和斑块性银屑病等的治疗。

反相色谱法是进行融合蛋白纯度检测的一种可行方法，艾杰尔-飞诺美采用bioZen 2.6 µm  WidePore C4色谱柱，通过简单的梯度程序调整，优化容量因子和保留时间，可以对依那西普的纯度进行检测。

依那西普完整蛋白和还原蛋白的色谱图

艾杰尔-飞诺美bioZen  WidePore C4 色谱柱结构特点

艾杰尔-飞诺美bioZen系列色谱柱，拥有丁基固定相以及更优孔径分布的核-壳颗粒，能够确保大分子分离的稳定性和重复性。

此外，重组蛋白还常常出现复杂的翻译后修饰，具有部分依赖二硫键的高度特异的三维结构，并且可能发生聚集、吸附和截短。准确的氨基酸序列、分子量、价态变化、糖基化、聚集水平以及氧化水平都是蛋白质药物表征的关键要素。因此，全面的化学、物理和构像表征对于了解重组蛋白药物的异质性、杂质谱和有效性是非常必要的。丹纳赫生命科学旗下艾杰尔-飞诺美和SCIEX能在重组蛋白药的表征上提供全面的解决方案。