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使用iPSC来源的人类神经元对神经元毒性进行高内涵筛选

发布时间: 2023-08-01 15:22 来源:美谷分子仪器(上海)有限公司
领域: 细胞生物学,蛋白/抗体/蛋白质组,神经科学/脑科学
资料类型:其他资料
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使用iPSC来源的人类神经元对神经元毒性进行高内涵筛选

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简介

神经系统对许多化合物、环境因素和某些天然物质的毒性作用非常敏感。在脊髓损伤、卒中或创伤性脑损伤等病理过程中,神经毒性可导致大脑或周围神经系统发生暂时或永久性损伤。它也是阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病的一个主要因素

使用人源诱导多能干细胞 (iPSCs) 进行高内涵成像可用于检查候选药品或环境污染物的神经营养、神经保护或神经毒性作用。本说明展示了使用 iPSCs  Molecular Devices 系统和软件通过自动化终点和活细胞检测进行神经元毒性筛选。

优势

• 通过真正自动化的采集和分析进行设置且无人值守

• 即时量化每个神经元的多个表型特征

• 监测活细胞数分钟或数天的实时毒性

基于 iPSC 的毒性筛选

iPSC 对神经元毒性研究非常有用,因为它们表现出成熟神经元的功能和行为,并且可用数量众多。此具有生物相关性的细胞类型与高内涵成像和分析结合使用使得神经毒性检测对于筛选先导化合物非常有价值,并有可能降低临床前开发成本和对动物实验的需要。使用来自 Cellular Dynamics International 的完全分化人 iPSC 源性 iCell 神经元开发了所展示的示例检测。

定量神经元网络的完整性

高内涵分可在 96 384 孔板中形成神经元网络 3-5 天,然后用有毒化合物进行 48-72 小时的挑战。在 ImageXpress Micro 系统上使用针对 ß-微管蛋白的标记抗体对神经元网络进行可视化。使用 MetaXpress高内涵图像采集和分析软件中的神经突生长应用模块进行图像分析,并使用 AcuityXpress 高内涵信息学软件分析数据。 

神经突生长应用模块可发现有或没有核复染的细胞体,通可在 96 384 孔板中形成神经元网络 3-5 天,然后用有毒化合物进行 48-72 小时的挑战。在 ImageXpress® Micro 系统上使用针对 ß-微管蛋白的标记抗体对神经元网络进行可视化。使用 MetaXpress® 高内涵图像采集和分析软件中的神经突生长应用模块进行图像分析,并使用 AcuityXpress 高内涵信息学软件分析数据。 

神经突生长应用模块可发现有或没有核复染的细胞体,通过细胞体的存在确定阳性神经元细胞,并识别从这些细胞延伸的荧光标记的神经突。几个参数可表征神经元网络,包括神经突数量、生长长度以及每个细胞或每个视野的分支数量。然后可以计算每个孔中细胞数量和表型的统计数据。

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化合物

IC MM

抗霉素 A

13.0

星孢菌素

0.9

MK571

4.1

丝裂霉素 C

0.7

1神经突生长应用模块结果。顶部:使用神经突生长应用模块产生的图像分析掩膜的对照和高剂量孔。标记为 ß -微管蛋白 III(绿色)的神经突细胞核(蓝色)。左下角:总生长细胞毒性化合物的剂量-反应曲线。右下角:根据总生长曲线计算 IC50 值。 

评估线粒体膜电位

线粒体去极化已被证明是缺氧损伤或细胞毒性的早期征兆,可使用 JC-10 染料监测线粒体膜电位(图 2)。在健康细胞中,JC-10 以橙色 J-聚集体的形式在线粒体中蓄积。随着内膜电位的损失,JC-10 的单体形式被释放到细胞质中,发出绿色荧光。

神经元用 JC-10 染色,并暴露于抗霉素 A 或缬氨酸霉素 30 分钟,抗霉素 A 或缬氨酸霉素是导致氧化呼吸中断和 Ca2+ 超载的化合物。MetaXpress 软件中的颗粒度模块可根据高于背景的强度和颗粒对象的大小进行定制以识别线粒体。将结果标准化为视野中的细胞计数。

监测活细胞毒性

可使用细胞染料Calcein AM Hoechst 细胞核染料组合对活细胞进行毒性检测。使用 带有能够维持孔板温度CO2 和湿度水平的环控装置的ImageXpress Micro 系统测试了许多已知的神经毒性和无毒性化合物(图 3)。观察到的这些化合物的神经毒性活性与体内或临床数据相关,从而证实了该测定法可用于预测性神经毒理学的可能性。

由于 Calcein AM 除对活神经元的细胞体外,还对神经元延伸进行染色,因此使用神经突生长应用模块对神经元网络进行分析,并且使用细胞分类应用模块通过 Calcein AM 染色和核大小来识别活神经元和死神经元。

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化合物

IC50nM

抗霉素 A

46

缬氨酸霉素

0.15

 2.  经抗霉素 A 处理的神经元。顶部对照神经元和经抗霉素 A 处理并用 JC-10 染色的神经元的图像。使用 20X 物镜采集显示的图像。底部:通过每个细胞的平均总线粒体/颗粒来测定剂量反应。

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3.  甲基汞对神经元的影响。顶部:显示甲基汞对神经元的剂量依赖性毒性作用的图像。Calcein AM 的存在表示活细胞的代谢(绿色)。左下角:通过神经突生长确定细胞毒性化合物的 IC50 曲线,并通过核大小评估细胞毒性。右下角:Hoechst 染色细胞核为伪彩红色。

用于神经元毒性筛选的完整解决方案

Molecular Devices 利用 ImageXpress Micro 系统、MetaXpress 软件和 AcuityXpress 软件为在筛选环境中评估神经元毒性提供完整的解决方案。我们的活细胞选项与复杂的表型图像分析相结合,可在药物开发的早期阶段识别毒性化合物。


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