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通过测量钙振荡及收缩模式来探索心脏功能

发布时间: 2023-08-03 11:14 来源:美谷分子仪器(上海)有限公司
领域: 细胞生物学
资料类型:其他资料
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通过测量钙振荡及收缩模式来探索心脏功能

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简介

药物开发过程的早期了解对心脏系统的影响对提高上市药物的安全性非常重要。心脏毒性被认为是临床前和临床试验期间药物流失的主要原因之一12。此外,环境化学暴露是心血管疾病的风险因素,但许多环境因素毒理学作用仍未得到充分的检测3

iPSC源性心肌细胞类似于原代心脏细胞的表型和功能,并可以避免使用原代细胞所带来的变异性。iPSC源性心肌细胞表现出同步自发收缩,可以被药物和化合物进行修饰使其成为生物学相关模型。虽然可以在透射光下记录机械性收缩,但也有研究表明,使用Ca2+ 敏感荧光染料观察到的钙振荡模式紊乱可用于测量对心肌细胞搏动率和模式的影响56。之前的应用文章中描述了使用ImageXpress® Micro高内涵成像系统在iPSC 源性心肌细胞中进行延时成像记录和分析钙振荡的方法4-6

这篇应用文章展示了MetaXpress分析工具用于观察和分析2D3D心肌细胞样品中Ca2+振荡信号轨迹的实用性。我们描述了荧光强度数据的生成,突出了在iPSC源性心肌细胞球上运行的目标物强度通量分析。此外,我们总结了生成多参数峰值读数的步骤,包括拍摄频率、峰值宽度、振幅和规律性。

Materials

• iCell心肌细胞2 FUJIFILM Cellular Dynamics Inc.

• iCell心肌细胞平板培养基 FUJIFILM Cellular Dynamics Inc.

• iCell心肌细胞维持培养基(FUJIFILM Cellular Dynamics Inc.

• 384孔微孔板(Corning,cat. # 3712

• 384 孔、低吸附、U型微孔板(Corning,cat. #3830

• 0.1% 明胶(Sigma, St. Louis, MO

• EarlyTox心脏毒性试剂盒或钙6染料 (Molecular Devices

• 采用ImageXpress Micro Confocal共聚焦高内涵成像系统6.5版本MetaXpress®图像采集分析软件(Molecular Devices

优势

• 记录2D3D心肌细胞样品中的Ca2+

分析复杂的动力学模式

测量荧光随时间推移的波动

生成多参数峰数据

高密度微孔板筛选化合物对心脏功能的复合效应

方法

根据实验方案,以2D3D检测形式培养人iPSC源性心肌细胞。对于传统的2D培养,将细胞以7000 个细胞/孔接种到384孔微孔板的明胶包被中。对于3D培养形式,将5000个细胞在明胶的存在下接种到低附着U384孔微孔板中。接种后45天,用已知有心脏活性和心脏毒性的化合物处理心肌细胞,浓度范围为100µM-0.3 µM,持续1小时、24小时和56。然后使用EarlyTox心毒性检测试剂盒或钙6染料对心肌细胞进行染色,这两种试剂盒均可检测心肌细胞收缩的动力学指标——细胞质钙水平的变化。延时成像程序设置为3-10 ms的曝光时间、0.1-0.3秒的时间间隔60-100个总时间点,在一个孔采集整个时间序列,然后采集下一个孔6。此快速动力学成像在ImageXpress Micro Confocal细胞成像系统以宽场模式进行采集(10X物镜FITC通道

MetaXpress软件中的Journal可用于自动化自定义图像采集、图像处理和图像分析工作流程。
使用JournalObject Intensity Flux只需点击一次即可运行和分析各种细胞和检测类型的振荡行为发现目标物并对其进行荧光强度振荡分析。图 1B 显示了该分析的心球图像。该方法测量图像荧光或明场强度随时间推移的重新分布。图1B显示了心肌细胞的分析图像。选择合适的标准化选项后,可用此方法对透射光下捕获的心肌细胞的无标记记录以及荧光样本记录进行分析。图1B显示了2D心肌细胞图像的强度变化分析。荧光强度和阈值百分比数据被绘制成图表并用于下游Ca2+振荡(表示心跳)多参数计算(图236

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1:细胞球和2D心肌细胞Ca2+振荡图的示意图。 使用6染料染色的细胞球和2DiPSC 源性心肌细胞的延时图像。A目标物强度通量分析利用最大荧光强度的图像来创建分割掩膜。该分割应用于给定细胞球的整个时间点图像集合,以测量荧光强度随时间的变化。B强度变化分析可测量荧光信号随时间的重新分布,并生成百分比阈值和平均荧光强度测量值。

图像分析

测定2D 3D心肌细胞样品单平面图像
细胞随时间推移的荧光强度波动以分析心脏细胞搏动

本应用手册中,我们ImageXpress Micro Confocal系统中以0.2 秒的时间间隔对iPSC源性心肌细胞的细胞球进行共60 个时间点的成像,并使用MetaXpress软件中的Object IntensityFlux进行分析。该分析可以从时间点图像集合中识别最大强度的细胞球图像,并使用该阈值来分割细胞球。该分割应用于给定孔的整个时间点图像集合,以测量平均荧光强度(图 1)。

数据分析

使用峰分析轨迹生成多个参数

通过绘制平均荧光强度与MetaXpress软件中时间的曲线以观察化合物处理后细胞内Ca2+ 的表型反应。图2展示的振荡强度图可以被用于优化峰值分析设置(图 3A),以最佳方式表示轨迹。如果细胞荧光强度存在孔间变化,可针对不同孔中峰之间的振幅和斜率阈值变化选择动态阈值功能进行调整(图 3A)。确保为所有孔准确找到峰SmoothWidth值是用于平滑峰数据的点数,应足够高,以平滑峰检测的噪声。过高的值最终将出现在未计数的实际峰值中,而过低的值则可能将噪声峰值视为峰值。为实现无噪音的完美数据,可将平滑宽度设置为1。拟合宽度是考虑峰宽度的数据点数,用于计算峰测量值,如振幅和宽度。

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2. 心脏毒性化合物的代表性钙流信号轨迹(平均荧光强度)。 所示迹线是典型的表型反应,包括未受影响的常规Ca2+通量(DMSO对照)模式,以及受影响的阿司咪唑、舒尼替尼、利培多、西沙必利和阿米替林模式。这些迹线代表处理24小时心肌细胞球的反应。

MetaXpress峰分析工具生成的测量值可以轻松导出为表格或文本文件。测量结果包括搏动率、峰值振幅、峰值宽度、上升和衰减时间以及规律性,可深入观察化合物处理后心脏搏动率和模式的变化(图 3B)。

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3. 使用MetaXpress分析法分析钙流信号轨迹(平均荧光强度)。(A用户界面设置和计算读数的截图。设置平滑宽度和拟合宽度,以最好地显示心脏搏动图中的轨迹。B与峰相关的峰分析测量值。

结论

MetaXpress软件6.5及更高版本具备记录和分析复杂动力学模式包括代表细胞收缩的钙振荡的能力。使用ImageXpress Micro系统对2D 3D心肌细胞培养物中的Ca2+ 振荡进行快速动力学荧光成像,并使用MetaXpress峰分析工具进行分析,能够对高密度微孔板中的心脏功能进行化合物筛选和研究。该一体化软件可无缝结合成像、分析生成图表和数据,从而提供未经处理和已处理样品中心脏搏动特征的完整视图,以便对候选药物进行早期鉴定或评估由环境因素引起的心脏毒性作用。

参考文献

1. Berridge BR, Hoffmann P, Turk JR, Sellke F, Gintant G, Hirkaler G, Dreher K, Schultze AE, Walker D, Edmunds N, Halpern W, Falls J, Sanders M, Pettit SD. Integrated and translational nonclinical in vivo cardiovascular risk assessment: Gaps and opportunities. Regul Toxicol Pharmacol. 2013;65:38–46. Web.

2. Laverty H, Benson C, Cartwright E, Cross M, Garland C, Hammond T, Holloway C, McMahon N, Milligan J, Park B, Pirmohamed M, Pollard C, Radford J, Roome N, Sager P, Singh S, Suter T, Suter W, Trafford A, Volders P, Wallis R, Weaver R, York M, Valentin J. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines? Br J Pharmacol. 2011;163:675–693. Web.

3. Judson R, Richard A, Dix DJ, Houck K, Martin M, Kavlock R, Dellarco V, Henry T, Holderman T, Sayre P, Tan S, Carpenter T, Smith E. The toxicity data landscape for environmental chemicals. Environ Health Perspect. 2009;117:685–695. Web.

4. Sirenko O, Crittenden C, Callamaras N, Hesley J, Chen YW, Funes C, Rusyn I, Anson B, Cromwell EF. Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using ipsc cells. J Biomol Screen. 2013a;18:39–53. Web.

5. Sirenko O, Cromwell EF, Crittenden C, Wignall JA, Wright FA, Rusyn I. Assessment of beating parameters in human induced pluripotent stem cells enables quantitative in vitro screening for cardiotoxicity. Toxicol Appl Pharmacol. 2013b;273:500–507. Web.

6. Sirenko O, Hancock MK, Crittenden C, Hammer M, Keating S, Carlson CB, Chandy G. “Phenotypic Assays for Characterizing Compound Effects on Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids.” Assay Drug Dev Technol. 2017 Aug/Sep;15(6):280-296. Web.

 


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