磷酸盐缓冲溶液配制方法及优化案例

缓冲液的作用是在一定的范围内缓冲调整溶液的pH值，使待测溶液的酸度符合分析方法所规定的范围。其中，磷酸盐缓冲液截止波长低于200nm，在较低分析波长下仍可使用，具有三个pKa值，可提供1.1~3.1，6.2~8.2，11.3~13.3三个pH缓冲范围，是HPLC在紫外检测条件下最常用的缓冲液之一。

配制磷酸盐缓冲液时，通常所说的浓度0.01M指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度，而非Na⁺或K⁺的浓度，Na⁺或K⁺的作用是调节渗透压。

母液的配制：

0.2M Na₂HPO₄：精密称取 28.392g Na₂HPO₄，溶于1L水中，超声使溶解完全；

 0.2M NaH₂PO₄：精密称取23.996g NaH₂PO₄，溶于1L水，超声使溶解完全。

各种浓度PB(pH=7.4)的配制：

先配0.2M PB（pH=7.4，100mL）：取0.2 mol/L的Na₂HPO₄母液81mL及0.2mol/L的NaH₂PO₄母液19mL，混匀。然后只需将0.2M PB（pH=7.4）按相应比例

适当稀释即可，如：

 0.1M PB（pH=7.4）：取500mL 0.2M PB，加水稀释至1L。

 0.01M PB（pH=7.4）：取50mL 0.2M PB，加水稀释至1L。

 0.02M PB（pH=7.4）：取100mL 0.2M PB，加水稀释至1L。

以上配制方法可供参考。日常配制流动相时常使用缓冲盐搭配酸/碱溶液进行pH调节。

在使用酸/碱溶液调节缓冲溶液的pH时，使用低浓度（0.1mol/L）比使用高浓度（1mol/L）引起的误差更小，对缓冲溶液pH的重复性和分析结果的重现性更有优势，尤其是针对一些对pH敏感的分析项目。

应用案例：

客户反馈参考应用报告的液相条件，同一台液相，不同天配制的流动相，配制方式一样，分离重现性不好，有时能分开，有时会重合无法分离。了解到客户称取磷酸盐后溶于1L超纯水中后，再滴加1mol/L碱溶液进行pH调节。此方法容易造成配制差异，引起峰分离情况差异。

优化流动相配制方法：

① 精密称取Mg±0.001g磷酸盐，溶于约800mL超纯水中溶解。

② 预先配制0.1mol/L氢氧化钠/氢氧化钾溶液，称样量Ng±0.001g，用量筒准确量取100mL碱溶液备用。

③ 将量取的碱溶液缓慢加入已溶解的磷酸盐溶液中，观察pH变化，达到目标pH后，停止加入碱溶液，记录所需碱溶液体积。

④ 再在缓冲盐溶液中加入超纯水定容至1L。

⑤ 后续配制只需量取固定体积的碱溶液加入固定称样量的缓冲溶液中，即可达到固定的pH。成功减小流动相配制差异，提高峰分离重现性。

效果见下图：

结论：

流动相pH的稳定性与准确性对样品分析的影响较大时，需尽量规避流动相配制时的人员误差，环境误差，仪器误差，物料称量误差等，以保证方法分析效果的重现性。