三维图形 xCELLigence RTCA DPlus实时无标记细胞分析仪

xCELLigence RTCA DPlus实时无标记细胞分析仪可以实现对各种贴壁细胞的检测，主要包扩细胞迁移和浸润检测、各种化合物对细胞的毒性检测、细胞间共培养检测、细胞的生长增殖检测、细胞粘附和伸展检测、受体介导的信号通路检测等。

RTCA DPlus系统的动态监测保证了细胞的瞬时响应及长时效应的获取。与xCELLigence RTCA DP仪器同样，其使用电子集成的Boyden室（CIM-Plate®16）进一步对细胞侵袭和迁移（CIM）进行动力学测量的能力。 DPlus仪器的三个支架允许三个独立的电子16孔板并联或彼此独立地进行控制和监控，从而实现多个用户的最大生产力。将仪器置于标准的CO2细胞培养箱中，并通过连接到外部的控制单元（笔记本电脑）的电缆进行供电和控制。用户友好的RTCA软件允许与所有三个支架实时接口，并包括实时数据显示和分析功能。

xCELLigence RTCA DPlus实时无标记细胞分析仪的检测灵敏性和预测性，实时数据采集特性，检测周期的短期及长期检测优势。

技术概述

细胞阻抗说明

在细胞生物化学测定和全身生物体内实验之间定位，基于细胞的测定是基础和应用生物学研究不可缺少的工具。然而，许多基于细胞的测定法的用途通过以下方式减少了：（1）需要使用标记；（2）与连续监测不相容（即仅产生终点数据）；（3）与正交试验不相容；和（ 4）无法提供客观/定量的读数。然而，这些缺点都是通过非侵入性的，无标记的和实时的细胞阻抗测定来克服的。 细胞阻抗测定的功能单元是融合到微量滴定板孔的底部表面的一组金微电极（图1）。当浸没在导电溶液（如缓冲液或标准组织培养基）中时，在这些电极上施加电位会使电子离开负极，通过本体溶液，然后沉积到正极端以完成电路。因为这种现象取决于电极与本体溶液相互作用，所以在电极 - 溶液界面处的粘附细胞的存在阻碍了电子流动。该阻抗的大小取决于细胞的数量，细胞的大小和形状以及细胞 - 基底附着质量。重要的是，金微电极表面和施加的电位（22 mV）都不影响细胞的健康或行为。

图1.细胞阻抗装置概述在单元格添加之前和之后显示单个孔的侧视图。电极和电池都不被拉伸（为了清晰起见，它们被放大）。在不存在电池的情况下，电流自由流动通过培养基，完成电极之间的电路。由于细胞在电极上粘附并增殖，电流流动受阻，提供了细胞数量，细胞大小/形态以及细胞 - 基质附着质量的非常灵敏的读数。

阻抗电极

ACEA E-Plate板中每孔中的金微电极生物传感器覆盖70-80％的表面积（取决于是否存在视野区域）。而不是图1所示的简化的电极对，E-Plate板的每个孔中的电极被连接成形成交错阵列的“线”（图2）。这种布置可以同时监测细胞群体，从而提供精确的灵敏度：附着于板的细胞数，细胞的大小/形态以及细胞 - 基质附着质量。

图2. ACEA E-Plate板上的阻抗电极。 （A）E-Plate板的每个孔中使用的叉指电极的简化示意图。电极没有按比例绘制（仅显示一些电极，为了清晰起见，它们已被放大）。虽然细胞也可以在金电极表面上可视化，但在中间的无电极区域有助于显微成像（亮场，荧光等）。 （B）16孔E-Plate板中单孔的照片。 （C）放大阴影电极和未染色人体细胞的明场图像。 （D）复合显微镜中观察到的金电极和结晶紫染色的人细胞。

用于实时电池移动/入侵的设备

尽管它可以与其他xCELLigence仪器一样运行测试，但是xCELLigence RTCA DP模型具有使用ACEA CIM-Plate进行实时细胞侵袭/迁移测定的附加功能，该实验基本上是电子集成的Boyden室。如图3A所示，将细胞直接置于微孔膜的顶部（迁移测定）上或在预先沉积在膜上的基底膜基质和/或细胞单层的顶部（入侵测定）上放置在上室中。移动到下腔室的化学引诱剂，细胞通过微孔膜，然后沉积到金阻抗电极上（在本技术概述的前两节中描述）。这提供了细胞迁移/侵袭的非常灵敏和可重复的连续动力学记录（图3B）。使用显微成像定量迁移细胞的平行测定证明了CIM-Plate的阻抗信号与已经迁移的细胞数量之间的完美相关性。

图3.细胞侵袭/迁移的定量实时分析。 （A）CIM板细节。上图显示了CIM-Plate八孔的剖视图。下图中的放大图示出了单个孔的上部和下部室。上室的底表面由细胞可以迁移穿过的微孔膜组成。该膜下侧的金电极检测粘附细胞的存在。对于简单的迁移测定（本文未示出），被监测的细胞将直接电镀在膜上。对于入侵测定（在此显示），将细胞铺在基底膜基质，细胞单层或其某些组合的顶部。 （B）在存在或不存在化学引诱物的情况下实时分析鼠巨噬细胞迁移。在没有细胞（阴性对照;蓝线）的情况下，阻抗信号在测定的75分钟内不变。虽然一些细胞在不存在化学引诱物（绿线）的情况下迁移通过多孔膜，但当化学引诱物存在于CIM板的下室（红线）时，巨噬细胞迁移显着刺激。图“B”改编自PLoS One。 2013年3月8（3）：e58744。

实时阻力跟踪说明

使用称为细胞指数（CI）的无单位参数报告了由贴壁细胞引起的电子流的阻抗，其中CI=(时间点n阻抗-不存在细胞时阻抗）/标称阻抗值。图3提供了在建立和运行凋亡实验过程中实时阻抗曲线的通用示例。在细胞添加到孔中的头几个小时之后，阻抗快速增加。这是由于悬浮液中的细胞脱落，沉积在电极上并形成局部粘连。如果添加的细胞的初始数量低，并且在井底上存在空的空间，则细胞将增殖，导致CI逐渐但稳定增加。当细胞达到汇合CI值时，反映了大容量介质可接近的电极表面积不再改变的事实。此时加入细胞凋亡诱导剂导致CI降低至零。这是细胞四舍五入，然后从井底分离的结果。虽然这个通用实例涉及细胞融合时的药物添加，基于阻抗的测定是非常灵活的，并且还可以评估初始细胞粘附到电极的速率和程度，或细胞增殖的速率和程度。

图4.用于建立和运行凋亡测定的通用实时阻抗曲线。 在文中解释了阻抗曲线的每个阶段及其产生的蜂窝行为。

超出上述通用示例，图5显示了使用ACEA的xCELLigence 实时无标记仪器中的E-Plate采集的实际实时阻抗数据。 图5A显示了将A549细胞加入到E-Plate板中的前两小时的阻抗曲线，其中孔预先用不同浓度的胶原IV包被。 虽然图5B显示了在将HeLa细胞暴露于GPCR激动剂多巴胺的前几分钟内发生的细胞指数的变化，图5C评估在20小时内NK细胞介导的癌细胞的细胞溶解。 图5D突出显示根据药物作用机制可能在细胞指数中发生的变化。

图5.使用E-Plate板和xCELLigence RTCA仪器获得的实时阻抗曲线示例。 （A）实时监测已经预先涂覆不同浓度胶原IV的E-Plate孔的A549细胞粘附。请注意阻抗值（细胞指数）与显微镜中可见的贴壁细胞数之间的相关性。 （B）暴露于不同浓度GPCR激动剂多巴胺的HeLa细胞的实时阻抗曲线。黑色箭头表示多巴胺加入的时间。 （C）用于NK细胞介导的MCF7乳腺癌细胞溶解的实时阻抗曲线。 （D）暴露于药物的A549细胞的实时阻抗曲线显示各种作用机制。

与细胞相关的阻抗

RTCA提供细胞数量，增殖率，细胞大小/形状和细胞 - 底物附着质量的定量读数。由于这些物理性质是数千种不同基因/蛋白质的产物，因此RTCA可以为细胞健康和行为提供非常广泛的视野。在xCELLigence仪器上已经成功地分析了从内皮屏障功能和趋化性到丝状伪足动力学和免疫细胞介导的细胞溶解的一切。尽管它们的广泛性，xCELLigence测定仍然能够询问非常具体的生化和细胞现象。适当使用对照和/或正交技术使得可以将阻抗迹线的特征与特定的细胞/分子现象相关联。

应用

病毒介导的细胞病变效应

病毒感染宿主细胞后，通常会选择性抑制宿主细胞的相关功能，并利用其物质进行自我复制，最终导致细胞裂解死亡，病毒进一步扩散。宿主细胞在病毒感染早期，通常会发生形态学的变化，如细胞变圆、从细胞培养板脱离等，而此时，便可用RTCA技术对这些变化进行检测。RTCA检测方法独具的灵敏性，也使得其非常适合于各种病毒学的实验研究，包括：基于病毒复制特性的细胞病变效应特征，对病毒株进行区分；病毒滴度测定、中和抗体效价测定，病毒—宿主细胞相互作用而发生的形态学变化研究等。

应用案例1 ：确定病毒滴度

传统的病毒滴定实验：空斑实验是一种既繁琐又费时的检测方法，而RTCA则独具优势。VERO细胞悬液加入梯度稀释的已知浓度的西尼罗河病毒（WNV），37℃静置反应30min，随后将细胞/病毒悬液加入到E-Plate培养板中。与处于融合平台期，未感染的对照细胞CI指数相比，病毒感染组细胞的CI值呈明显的时间梯度依赖性，随时间延迟，CI曲线一直呈下降的趋势，直至零，说明细胞已完全裂解（图1A）。重要的是，CPE产生的时间与病毒滴度呈现良好的相关性，可用CIT50（即CI值下降到50%所需要的时间）作为定量描述病毒滴度的参数（图1B）。通过标曲，即可确定未知浓度样品的病毒滴度。

图1. 西尼罗河病毒致细胞病变作用的实时监测。（A）时间-滴度依赖的西尼罗河病毒（WNV）致细胞病变效应。Vero细胞与梯度稀释的西尼罗河病毒孵育后，接种在E-Plate培养板中，xCelligence细胞分析系统实时监测200小时。图中水平线表示CIT50值（即细胞指数下降50%所需的时间）。（B）病毒致细胞病变效应的时间与病毒滴度的相关性。CIT50与已知浓度梯度的病毒滴度拟合的相关性曲线。此数据来源于J Virol Methods. 2011 May;173(2):251-8. 

应用案例2 ：评估适应性和识别不同病毒株分离株

目前，研究者可以用ELISA、PCR、RT-PCR、Western blotting、空斑实验、免疫荧光等实验技术对病毒株进行鉴定和多方面的评估。由于病毒致细胞病变效应的动力学特异性，xCELLigence实时细胞分析系统（RTCA）可以用来代替或作为这些传统的方法的补偿，对病毒株进行评估和鉴定。下面例子中，研究者使用xCelligence RTCA技术监测了西尼罗河病毒（WNV）和圣路易斯脑炎病毒（Slev）相同感染复数下，Vero细胞的CPE效应曲线。如图2所示，这两种病毒感染后引起的CPE起始时间和细胞完全裂解死亡的时间都不尽相同。这种基于RTCA检测的动力学曲线即可用于评估不同病毒株的亲缘关系，或对病毒株进行鉴定。

图2. RTCA实时监控由西尼罗河病毒（WNV）和圣路易斯脑炎病毒（Slev）引起的细胞病变效应。用感染复数相同的WNV或Slev病毒感染Vero细胞，随后将细胞/病毒悬液加入到E-Plate培养板中。尽管WNV和Slev属于相同的种，但其CPE权限也显示出很大的差异：他们在不同时间引起细胞病变效应，并且从细胞完成完全裂解时间来看，Slev病毒比WNV病毒延迟了55小时。该数据来源于 J Virol Methods. 2011 May;173(2):251-8.

应用案例3 ：确定中和抗体效价

除了用于治疗或预防目的外，中和抗体也可作为感染的诊断标志。测定样本中抗体是否存在或抗体浓度的一种方法即直接测定样本中和病毒感染的能力。 xCELLigence实时细胞分析系统因其极高的实验重复性、简便的实验步骤，使它非常适合于这种类型的实验。图3A，Vero细胞与固定量的西尼罗河病毒（WNV）共培养，该病毒是经含有已知浓度的病毒中和抗体的抗血清提前处理过的。不同样本之间细胞出现细胞病变效应的时间（即细胞指数降到零）存在显著差异。正如预期的那样，高稀释倍数下，抗血清的中和能力下降。绘制CIT50（即细胞指数下降50%所需的时间）和已知中和抗体效价关系的标准曲线（图3B）。该曲线可用于未知浓度样品中和抗体效价的测定。

图3. 中和抗体效价的定量测定。（A）Vero细胞与定量的西尼罗河病毒（WNV）培养，该病毒是经含有已知浓度的病毒中和抗体的抗血清提前处理过的，而阴性对照（未用病毒处理）则显示出稳定的细胞指数，阳性对照组（加入了未经抗血清处理的病毒）细胞病变效应（CPE）快速出现；抗血清处理则后，CPE被延迟。（B）抗血清/中和抗体滴度与CPE发生时间的相关性。绘制CIT50（即细胞指数下降50%所需的时间）和已知中和抗体效价关系的标准曲线。该数据来源于 J Virol Methods. 2011 May;173(2):251-8.

xCELLigence®在病毒介导的细胞病变应用的优势如下：

1、病毒滴度测定：自动、简洁、可替代空斑实验；

2 、评估病毒株：应用病毒介导的细胞病变效应动力学曲线可以非常容易的评估、确定病毒株（野生型/突变体）；

3 、确认病毒的身份：通过病毒介导的细胞病变效应动力学曲线可以帮助我们确认病毒的身份；

4 、量化中和抗体效价：CPE和抗体浓度呈现相关性，可据此绘制出标准曲线，并用于未知浓度样品中和抗体的定量；

5、快速优化检测方法：快速测定病毒梯度，有效筛选抑制化合物、中和抗体和中和血清。

软件

预定义的协议指导您在几秒钟内完成实验设置和分析

图1.Layout：定义E-Plate板中样本的排布布局（例如：细胞类型、细胞数目、化合物名称、化合物浓度）。

对于xCELLigence RTCA DP、DPlus、TP、SP和MP仪器实验进行编程和执行，并使用RTCA 2.1软件对数据进行分析。该软件可实现轻松的实验设置和执行以及强大的数据分析，同时仍然保持高效和直观。软件如何运行和分析实验的一般概要如下所示。

步骤1：记录E-Plate板布局

使用直观的图形界面，记录实时微电子检测板（E-Plate®板）中每个孔的阻抗值（图1）。孔的信息领域包括细胞类型，细胞数量，药物特性，药物浓度等参数。表格自动填充功能类似于Excel或其他电子表格程序中可用的功能，可以快速输入数据并自动建立药物浓度梯度，细胞数梯度等。即使正在检查多种细胞类型和测定条件，记录板的所有孔的信息只需几分钟。

步骤2：定义数据采集参数

使用第二个表定义数据采集的细节。这些包括阻抗记录的频率和实验持续时间。

步骤3：运行实验

按“Run”并观察，因为板中的每个孔都会实时获取阻抗数据。即使正在获取数据，也可以查看，图形化操作，分析和导出。

步骤4：数据绘图和分析

使用直观的图形界面，可以绘制来自E-Plate的所有孔或单个孔的实时阻抗数据（图2A）。可以对来自多个孔的数据进行平均，并自动计算和绘制变异系数。可以容易地调整x轴和y轴的观察窗口，并且可以将数据轨迹归一化到特定的时间点（例如在药物添加之前）。最后，曲线拟合功能可以计算变化率，EC50值等（图2B）。

图2.使用RTCA DPlus1.0软件的数据绘图和分析。 （A）数据绘图/分析窗口的屏幕截图。这里所有的曲线已经被归一化到药物治疗之前的时间点（用粗体后行垂直线表示）。误差条表示变异系数。 （B）剂量反应曲线。将细胞指数值（在药物治疗后的特定时间）作为药物浓度的函数，可以确定EC50值和IC50值。这些类型的计算可以使用内置的数据分析功能轻松执行。