3D单分子荧光成像系统-SAFe 360

3D单分子荧光成像系统-SAFe 360

SAFe 360是法国abbelight公司推出的一款基于单分子定位的显微成像（SMLM）的新型3D单分子成像系统，它独有的DAISY技术整合了散光技术和超临界角光技术，能够极大提高定位精度，xyz三轴定位精度高达15nm，可以提供高清晰三维亚细胞结构图像，支持同时四色成像，可以用于细胞纳米三维成像，观测高清晰亚细胞器结构，实时研究不同的结构功能蛋白的共定位信息，在单分子水平研究分子动力学反应以及细胞间的相互作用等。

设备参数

+ 成像模式：PALM、STORM、PAINT、smFRET 、SPT

+ 光源模式：Epi、TIRF、HILO

+ 最高分辨率：15 nm的XYZ轴分辨率

+ 超大视野：200 × 200 μm²的视野

+  一次可同时采集1.2 μm深度图像信息

+  最高图像深度：10 μm

+  实时漂移矫正

+  最高四色同时成像

+  活细胞成像模式

配套试剂

应用案例

研究细胞质膜上的内陷结构与功能

真核细胞的细胞质膜是一个不均一体系，包含大量脂类组成和生物物理特性不同的区域。这些蛋白脂类区域使质膜产生内陷，而内陷在胞吞过程中起重要作用。在这些质膜区域中，网格蛋白包被的小窝(clathin coated pits, CCP)和胞膜窖(caveolae)由于表面有明显的蛋白包被，很容易用电镜成像等方法观测到。CCP呈80-120 nm的球形结构，包被有网格蛋白和衔接蛋白。网格蛋白调控的内吞作用通路(CME)通过被膜小窝实现胞吞。Caveolae是50-80 nm的内陷结构，在信号转导，膜运输，胆固醇运输，机械传感等过程中起作用，在受到机械应力作用的细胞，如脂肪细胞，内皮细胞和肌细胞中含量较高。有研究发现了小凹的产生及与胞内体的融合，但Caveolae是否在胞吞中起作用尚无定论。

在下图的实例中，研究人员使用了Abbelight的成像3D单分子荧光成像系统-SAFe 360分辨出了内皮细胞中的Clathrin和Caveolae。结果显示了清晰、无重叠的荧光分布，与电镜成像结果一致。

图1. Abbelight SAFe360系统重现质膜上蛋白脂类区域的蛋白分布

图2. 通过SAFe360的同时多色成像功能可以清晰、无重叠地区分Clathrin 和Caveolae，进一步研究Clathrin 和Caveolae的内吞作用通路的相互关系。

■  研究大肠杆菌RNA聚合酶的空间分布与动力学

大肠杆菌中的RNA聚合酶(RNAP)空间上呈拟核形状分布，是核糖体RNA(rRNA)的转录中心。下方实例使用Abbelight SAFe 360系统通过PALM超分辨成像与单分子追踪(sptPALM)解析大肠杆菌RNAP的纳米尺度空间分布与动力学，进而研究转录调控机制。

图1. (A)Denndra2标记RNAP在大肠杆菌中分布定位(定位精度约为15 nm)；（B）通过DBSCAN算法对大肠杆菌中RNA聚合酶分布进行团簇分析。

图2. 在活细胞中以200 FPS(5 ms/帧)的采集速度对大肠杆菌中Dendra2标记的RNAP分子进行单分子追踪以研究单个RNAP分子运动轨迹，按照运动状态分为静态(红色，即转录中)或动态(紫色，扩散运动)。

测试数据

发表文章

[1] Radhakrishnan, A. V., et al. “Single-Protein Tracking to Study Protein Interactions During Integrin-Based Migration.“ The Integrin Interactome. Humana, New York, NY, (2021). 85-113.

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[3] Pernier, Julien, et al. “Myosin 1b flattens and prunes branched actin filaments.“ Journal of cell science 133.18 (2020).

[4] Jimenez, Angélique, Karoline Friedl, and Christophe Leterrier. “About samples, giving examples: optimized single molecule localization microscopy.“ Methods 174 (2020): 100-114.

[5] Mau, Adrien, et al. “Fast scanned widefield scheme provides tunable and uniform illumination for optimized SMLM on large fields of view.“ bioRxiv (2020).

[6] Orre, Thomas, et al. “Molecular motion and tridimensional nanoscale localization of kindlin control integrin activation in focal adhesions.“ bioRxiv (2020).

[7] Cabriel, Clément, et al. “Combining 3D single molecule localization strategies for reproducible bioimaging.“ Nature communications 10.1 (2019): 1980.

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[9] Belkahla, Hanen, et al. “Carbon dots, a powerful non-toxic support for bioimaging by fluorescence nanoscopy and eradication of bacteria by photothermia.“ Nanoscale Advances (2019).

[10] Denis, Kevin, et al. “Targeting Type IV pili as an antivirulence strategy against invasive meningococcal disease.“ Nature microbiology 4.6 (2019): 972.

[11] Szabo, Quentin, et al. “TADs are 3D structural units of higher-order chromosome organization in Drosophila.“ Science advances 4.2 (2018): eaar8082. 

[12] Boudjemaa, Rym, et al. “Impact of bacterial membrane fatty acid composition on the failure of daptomycin to kill Staphylococcus aureus.“ Antimicrobial agents and chemotherapy 62.7 (2018): e00023-18.

[13] Culley, Siân, et al. “Quantitative mapping and minimization of super-resolution optical imaging artifacts.“ Nature methods 15.4 (2018): 263.

[14] Berger, Stephen L., et al. “Localized myosin II activity regulates assembly and plasticity of the axon initial segment.“ Neuron 97.3 (2018): 555-570.

[15] Cabriel, Clément, et al. “Aberration-accounting calibration for 3D single-molecule localization microscopy.“ Optics letters 43.2 (2018): 174-177. 

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[18] Bourg, Nicolas, et al. “Direct optical nanoscopy with axially localized detection.“ Nature Photonics 9.9 (2015): 587. 

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