美国Bio-Rad伯乐DGGE变性梯度凝胶电泳

通过 DGGE 发现未知突变

DGGE 的原理是提高变性剂浓度将熔解不同区域内的双链 DNA。 当达到解链温度zei低区域的熔解温度 (Tm) 时，DNA 将会部分熔解，在聚丙烯酰胺凝胶中会产生迁移率降低的带分支的分子（Myers et al. 1987）。 变性环境是由介于 50 和 65°C 之间的均匀运行温度和使用尿素和甲酰胺形成的线性变性梯度创建的。 梯度可以在垂直或平行于电泳的方向形成。 DGGE 是zei敏感的突变检测方法之一，效率高达 99% (Grompe 1993)。 

DCode 系统通过以下方式优化了 DGGE：

• 使用获得zl的凸轮操作 475 型梯度仪，梯度胶灌制变得非常简单

• WinMelt™ 软件简化了 GC 夹和引物的放置

• 温度控制模块提供介于 45 和 70°C 之间的一致的运行温度。

• 运行zei多两个 16 x 16 cm 凝胶或四个 7.5 x 10 cm 凝胶

变性梯度垂直于电泳方向的垂直变性梯度胶示例。 本例显示单个解链区域。 在变性剂浓度较低（左侧）的情况下，DNA 片段会保持为双链，但随着浓度的增加（向右侧移动），DNA 片段开始溶解，从而产生带分支的分子。 在浓度非常高的情况下，DNA 片段可以完全溶解，从而产生两个单链。

A，变性梯度垂直于电泳方向的垂直变性梯度胶。 p53 基因的外显子 6 的突变型和野生型等位基因是从原发性乳腺癌扩增的，并由垂直 DGGE（0–70% 变性剂）分离，在 56°C 以 80 V 电压运行 2 小时（数据由挪威奥斯陆 Radium 医院 AL Borresen 提供，在此表示感谢）。 

B，梯度平行于电泳方向的平行变性梯度胶。 已使用并行梯度为 40–65% 的变性剂在 8%（丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺为 37.5:1）的凝胶中对 p53 基因的外显子 8 的突变型和野生型等位基因进行了电泳。 凝胶在 150 V 下于 60°C 的 1x TAE 缓冲液中运行了 2.5 小时。 通道 1：突变体片段；通道 2：野生型片段；通道 3：突变体和野生型片段。

参考

Grompe M (1993). 快速检测核酸中的未知突变。 Nat Genet 5, 111-117.

Myers RM et al. (1987). 通过变性梯度胶电泳检测和定位单碱变化。 Methods Enzymol 155、501-527。Scroll up

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运用DGGE搜寻未知突变

DGGE 是基于以下原理，即增加聚丙烯酰胺凝胶内变性剂的浓度会熔解双链DNA 的不同区域。当温度达到zui低熔解度区域的熔解温度Tm 时，DNA 部分熔解，在凝胶中形成迁移率下降的分支分子（Myers et al.1987）。在均一的运行温度（50—65°C）和尿素与甲酰胺线性变性梯度条件下即形成了变性环境。梯度以垂直或平行于电泳方向形成。DGGE 是zui灵敏的突变检测方法，其效率可达99%（Grompe 1993）。

DCode 系统通过以下途径优化DGGE：

• 温度控制模块提供45–70°C 内的一致运行温度

• 系统可运行2 块16 x 16 cm 凝胶或4 块7.5 x 10 cm 凝胶

• 可选择的MacMelt 或WinMelt 软件优化了GC 夹及引物的置放

DGGE 的两种模式。

A ，凝胶的变性梯度方向与电泳方向垂直。从原生乳腺癌种扩增的p53 基因6 号外显子的野生型和突变型等位基因通过垂直DGGE（80V，56°C，2 小时）分离。感谢AL Borresen, Radium Hospital, Oslo, Norway 提供的数据。

B ，凝胶的变性梯度方向与电泳方向平行。p53 基因8 号外显子的野生型和突变型等位基因在8%丙烯酰胺：甲叉37.5：1 平行梯度（40–65% 变性剂）凝胶上，1 x TAE 缓冲液， 60°C，150 V，电泳2.5 个小时。左泳道，突变型等位基因；中，野生型等位基因；右，突变型与野生型等位基因。

DGGE分离示意图。所示为一个变性梯度方向与电泳方向垂直的凝胶，以及一个有单个熔解区域的目标序列。野生型和突变型样品加入到制备孔内。在低变性剂浓度时，DNA 片段为双链，但当浓度增加时双链DNA 开始熔解，形成分枝分子。到浓度非常高时，DNA 片段可熔解形成2条单链。

DCode 系统

筛选染色体 DNA 中的未知突变对于研究疾病、紊乱（包括癌症）的遗传基础非常重要。 此外，检查 DNA 多态性对陆地生物、海洋生物和微生物的生态和进化研究大有帮助，应用范围包括鉴定物种、种群结构和监控遗传多样性。

DCode 通用突变检测系统可采用以下任一电泳技术检测单碱基变化：

• 单链构象多态性 (SSCP)

• 变性梯度凝胶电泳 (DGGE)

• 均一变性凝胶电泳 (CDGE)

• 时间温度梯度电泳 (TTGE)

DCode 系统灵活且功能强大，是可以执行任何技术组合的电泳系统。 系统中央是温度控制模块（该模块包括一个由微处理器控制的加热器、一个缓冲液再循环泵和一个搅拌器）。 对于需要精确温度控制的技术（例如 SSCP 和 TTGE），请将凝胶浸入缓冲液中，并将温度调节在 5° 和 70°C 之间。将冷却槽与外部实验室冷却器结合使用可以实现低于环境温度的任何运行温度。 DCode 系统运行 64 份样品只需 2 小时 — 筛选 DNA 以了解序列变化时，可重点考虑该系统。

您可以根据实验需求对DCode 系统进行相应配置。 每个系统包括一个垂直电泳槽和各种针对 SSCP、DGGE、CDGE 和 TTGE（一种由 Bio-Rad 共同研发的技术）所适用的试剂盒。 作为一种由 Bio-Rad 共同研发的技术，TTGE 具有 DGGE 和 CDGE 的所有优点且不需要化学变性剂梯度。

这种系统的灵活性使您能够快速添加新的研究工具而不需要投资购买新仪器。 通过使用“Accessories”（配件）选项卡上列出的特定技术的适配试剂盒补充核心系统，可将检测系统扩展为执行任意检测方法的系统组合。 产品选项包括完整的 DCode 系统及针对不同电泳技术（DDGE、CDGE、TTGE 和 SSCP）的 DCode 系统。

WinMelt™ 软件

当序列差异出现在相关 DNA 的zei低解链温度区域时，突变zei容易检出。 此外，仅当分子未完全变性时，才能获得zei佳电泳分辨率。 通过 PCR 将 GC 钳添加到 DNA 的一端可确保筛选的区域处于较低的解链温度范围内，并且 DNA 将部分保留双链。 这样同时增强了检测电泳能力和分辨率。 基于 Windows 的 WinMelt 软件可以预测zei多达 3,200 个碱基的任何 DNA 序列的解链图谱。 可以通过分析引物和 GC 钳对 DNA 解链图谱的影响来优化它们的位置。

WinMelt 软件的操作很简单。 DNA 序列支持文本文件导入，解链图谱可计算生成。 该数据显示在屏幕上，并且可根据用户需要将其绘制成图表。同时可导出序列和熔解数据以便用于其他程序。 WinMelt 软件推荐用于所有 DGGE、CDGE 和 TTGE 应用。

电泳试剂和对照试剂

Bio-Rad 电泳检测试剂盒针对每种应用而定制，可确保提供品质zei佳的缓冲液和丙烯酰胺凝胶。 我们的 DGGE、CDGE、TTGE 和 SSCP 对照试剂可帮助您快速掌握任何新技术。

应用

提供包含已验证的 DCode 系统运行条件的技术注解。 要获得所有 DCode 系统应用说明，请索取文献包 1720J。 要在微生物多样性研究方面获得 DCode 系统应用说明，请索取文献包 1720K。

培训指南

培训指南是一种交互式 CD-ROM，可帮助您了解使用 DCode 系统筛选突变的技术。 它包括以下内容：

• DGGE、CDGE、TTGE 和 SSCP 的原理

• 有关设置和使用 DCode 系统的视频

• WinMelt 软件教程程序、DCode 应用说明、适用手册和其他文献

要获得培训指南，请索取货号 170-9241。 该 CD-ROM 只与 PC 兼容。

D GENE™ 用户注意

除 SSCP 适配试剂盒以外，所有 DCode 适配试剂盒都与 D GENE 仪器兼容。 要在室温以下运行凝胶，请将 D GENE 系统放在冷库或配备电源插座的致冷器中，并使用温度控制器设置所需的运行温度（bullitin 1935）。 基本 SSCP 适配试剂盒与 D GENE 系统相容，但需要使用一个低于室温的电泳冷库。

The DCode universal mutation detection system has a vertical electrophoresis cell with adaptors for different techniques for identification of single-base changes, providing a simple, efficient, and flexible system for screening and identifying polymorphisms. Use the same system for high-throughput screening for a mutation or hunting for unknowns.

The DCode system can identify single-base changes using any combination of the following electrophoretic techniques:

• Single-stranded conformation polymorphism (SSCP)

• Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)

• Constant denaturing gel electrophoresis (CDGE)

• Temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE)

• A unique feature of the DCode system is the ability to perform TTGE. This type of analysis, codeveloped by Bio-Rad, has the advantage of not using a denaturing chemical gradient gel, as is required for DGGE and to optimize CDGE. The denaturing chemical gradient is replaced with a linear temperature gradient, eliminating the need for casting gradient gels. TTGE provides faster, simpler and increased reproducibility of detection of single-base changes.

Features of the DCode universal mutation detection system:

• Run up to 64 samples in as little as 2 hours

• Accurate temperature control options for electrophoresis runs between 5° and 70°

• Temperature ramp as low as 0.1°C/hr

• MacMelt and WinMelt software help determine optimal temperature ranges, as well as GC clamp and primer placement

• Gradients may be formed parallel or perpendicular to the direction of electrophoresis

• Modular design for customizing current and future laboratory demands

• Different plate dimensions available, including 20 x 16, 16 x 16, 10 x 16 and 7.5 x 16 cm

• Depending on plate dimensions, run up to four gels simultaneously

• Specialized accessory kits that simplify startup

• Technique-specific reagents and controls that are optimized for DGGE, CDGE, SSCP, and TTGE