报告基因的应用
实验概要
报告基因被广泛地应用于细胞生物学中的基因表达和细胞相关内容的研究。常用的报告基因主要有GUS基因、CAT基因、hGH基因、Cato2ase基因、绿色荧光蛋白基因及萤火虫荧光素酶基因等。在这些报告基因中萤火虫荧光素酶基因因其表达产物－荧光素酶敏感性高，测定方法快速且宜于掌握，线性好，并且荧光素酶产生的光产物是在已知的化学光敏反应中产生光量子最高的，荧光素酶是一蛋白质单体（61KD)，对酶活而言，不需要次级转录过程。因此，荧光素酶基因能够作为转录研究中的一类重要的报告基因。Promega公司的荧光素酶分析系统允许荧光素酶的更大折叠，从而产生了持续几分钟的高的光密度。利用Promega公司荧光素酶分析系统产生持续光密度，使得自动注射装置成为非必需品。简单的分析过程适用于不同的测量设备，例如用闪烁计数器或摄影胶片。荧光酶分析系统在8个量值上是线性的，甚至少于10-20摩尔的荧光素酶在理想条件下就能检测到。通常，用户能够获得比氯霉素乙酰转移酶分析系统大100倍的光密度。
主要试剂
荧光素酶分析系统试剂盒
PBS缓冲液(不含Mg2 Ca2 )
荧光素酶分析底物
荧光素酶分析缓冲液
5×细胞培养裂解液
主要设备
控温仪、荧光检测器
实验步骤
1. 加4倍体积的水于1体积的5×细胞裂解液试剂中，使最终浓度成为1×，平衡1×试剂并使荧光素酶分析试剂至室温。
2. 去除培养基，并用PBS缓冲液仔细洗涤细胞两次，不能丢失细胞。
3. 用1×细胞裂解液试剂覆盖细胞（最小体积）。
4. 将附着在培养基上的细胞刮下，将溶解的细胞转移到微量离心管中12，000×g下5秒。
5. 将20ul室温下的细胞提取物与100ul荧光素酶分析试剂混合。
6. 酶活性检测。
注意事项
1. 冷冻荧光素酶分析试剂不能在25℃以上溶化，且刚溶化的试剂必须混合后才能使用。
2. 荧光素酶最适反应温度为室温，且酶活性在室温下可稳定存在数小时，但荧光量子反应半衰期为5分钟。
3. 对于植物组织，用液氮快速冷却，将组织磨成粉末，在室温下用1×缓冲液悬浮。离心以后去碎片，用标准条件测量。
4. 对于细菌，将40ul的细菌与50ul的转移液混合，加入10ul的1MK2HPO4，pH7.8，20mM的EDTA。用干冰快速冷冻混合物，然后在室温水中用试管将混合物平衡至室温。加入300ul新鲜制备的裂解混合物，(1体积的新鲜裂解物加入2体积的2×细胞裂解试剂，5mg/mlBSA)混合物及培养的细胞在室温下放置10分钟。最终试剂浓度为1×细胞裂解液，2.5mg/ml BSA，1.25mg/ml溶菌酶。
