沃特世重新定义UHPLC和UPLC的新界限
2004年沃特世推出UPLC，带动众多液相色谱厂家，打造了一个更小颗粒、更高效率的液相色谱新市场，推动了液相色谱技术的进步。时隔11年后，沃特世推出ACQUITY Arc UHPLC，就像它的名字一样，宛如一架拱桥，架起从传统HPLC到UPLC的桥梁。HPLC大家都知道，那么问题来了，作为桥梁的UHPLC和UPLC有什么区别呢？
笔者查了很多解释，获得了对液相色谱前世今生的认识，但关于UHPLC和UPLC的区别都没有明确的答案，近期我们采访了沃特世中国市场发展部负责人叶瑞莉女士，她用新的分类方法和详实的数据，为我们重新定义了UHPLC和UPLC的新界限。如果您对于这个问题也觉得迷惑，那么就请随我们一起来探个究竟吧。
液相色谱发展史
LC(Liquid Chromatography)：1903年俄国植物化学家茨维特（Tswett）首次提出“色谱法”（Chromotography）和“色谱图”（Chromatogram）的概念。然而受制造技术和理论发展缓慢的影响，之后液相色谱一度沉寂，没有大步发展。
HPLC(High Performance Liquid Chromatography)：上世纪60年代，随着气相色谱理论和实践发展，机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱又开始活跃。科克兰（Kirkland）等人把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，开发了世界上第一台高效液相色谱仪（HPLC）；Waters公司随后推出了世界上第一台商品化的HPLC。随着计算机技术的推动和HPLC理论的发展，HPLC已成为现代主流分析检测仪器。同时与HPLC息息相关的色谱柱，也从最初的无定形颗粒，发展到全多孔颗粒，大大增强了分离效能。填料颗粒度由最初的100μm随技术发展不断减小，80年代普遍使用5μm全多孔硅胶，传统HPLC将5μm填料颗粒的柱子的效能发挥到最佳。常见系统有岛津Prominence HPLC，安捷伦1260VL，Waters Alliance。
UPLC（Ultra Performance Liquid Chromatography）：2000年初，Waters研发出更小粒径亚2μm颗粒度的色谱柱，与5μm色谱柱相比，它可以帮助色谱工作者带来更好的分离效果。然而常规的液相产品较大的扩散体积无法将亚2μm色谱柱的性能优势体现出来，因此Waters公司推出了超高效液相系统（UPLC，Ultra Performance Liquid Chromatography）。UPLC具有超低扩散体积（小于15μL）可将亚2μm色谱柱性能发挥到极致。色谱工作者使用UPLC结合小颗粒色谱柱可以获得更好的分离度，灵敏度，更快的分析速度。
UHPLC（Ultra High Performance Liquid Chromatography）： 在Waters UPLC 技术推出来之后，其他公司陆续推出超高压液相系统， 比如Agilent公司就在2005年紧接着推出1200 RRLC 600bar 仪器。可以说，UHPLC的诞生是UPLC 对色谱分离技术带来的一系列变化之一。UHPLC在制造技术，扩散体积和耐受压力方面进行了优化，使之能够匹配2.5～3.5μm颗粒度的柱子，最大限度发挥色谱性能。UHPLC是目前使用最为广泛的液相色谱仪,常见系统多有安捷伦1260SL，岛津Prominence UFLC，Thermo Ultimate3000。最近，Waters的ACQUITY Arc加入了这个阵营。
液相色谱的发展历史
色谱填料的发展和色谱的发展紧密交织
要完成一个液相色谱方法，除了色谱仪器本身，色谱柱必不可少，它是色谱的灵魂，而色谱柱的核心就是色谱填料。顺便说一句，笔者看到的事实是：如果只做色谱填料，或只做仪器，都不会成为分离科学领域顶尖的公司，那些牛×的公司都是两者都做的，包括：Waters、Agilent、GE等等。因为客户要的是整套方法，完整的性能，只有两者都做，设计人员才能不断在色谱填料性能达到更高时去调整仪器，根据不同的仪器性能再去设计不同的色谱填料，为的就是在某套配置、某种填料下，让整套系统发挥最好的性能。
那么我们再来回顾一下色谱填料的发展历史。
液相色谱仪刚出现时匹配的主要色谱柱填料是 10μm 无定型硅胶颗粒；后发展为5-10μm 的球形硅胶；上世纪 90 年代，出现了 3μm 或 3.5μm 粒径的球形硅胶，能够进行相对快速的分离，也对液相色谱系统性能产生了一定的要求；而而此后又由Waters公司率先研发出亚2μm的杂化颗粒色谱柱填料，极大的提高色谱柱分离性能。
最合适的匹配，才能有效发挥系统性能，获得最佳分离效果
在实际使用上，要使色谱柱发挥最大分离效能，一定要选择合适的液相色谱。下表是色谱柱和其最合适的色谱系统的关系。
| 填料粒径 | 内径 | 最合适 | 常规流速 |
| 5μm | 4.6mm | 普通HPLC | ≤3mL/min |
| 2-3.5μm | 3.0mm | UHPLC | ≤2mL/min |
| 亚2μm | 2.1mm | UPLC | ≤1mL/min |
关键问题：HPLC、UHPLC和UPLC的区别
怎样为不同粒径色谱柱选择最匹配的液相色谱系统？这就回到了本文的重点：普通HPLC、UHPLC和UPLC到底应该怎么区分？
它们只是必要条件，不足以保证超高效分离
色谱的用途是分离，追求更高的分离性能是色谱的终极目标。那么区分HPLC、UHPLC、UPLC的关键点就是分离性能。
很多人会说，色谱柱填料粒径小了不就分离性能高了么？
No！这是获得高分离效能的一个必要条件。粒径小了，只是柱内扩散体积小了。
市场上还有一个更混淆的解释，只要能耐更高的压力，比如到了15,000 PSI，那就是超高效液相色谱了。这就更是偷换概念，舍本逐末的说法。如要发挥更小粒径填料的性能，可能会造成系统反压增高，就需要系统耐受更高压力。但造出耐受更高压力的色谱系统不难，真正难的是：造出的系统能否发挥更小粒径填料的性能，给客户真正的超高效。
所以，不管是UHPLC，还是UPLC，最终追求的都是超高效，而不是超高压。当然，超高压也是一个必要条件：如不能耐受超高压，那么系统运行小粒径填料时，说不定会崩溃的！
充分必要条件到底是什么？
小粒径、耐高压都是超高效色谱系统的必要条件，那么达到充分必要条件的最后一环是什么？
首先我们先看看色谱峰是怎样形成的。如下图所示，分析物从进入系统开始到出检测器得到信号，最后由计算机工作站处理得到了色谱峰。所以色谱峰是分析物在色谱系统里形成的谱带。
色谱峰的形成
色谱峰峰宽随着谱带展宽而变宽，峰高随之降低，同时伴随着灵敏度和分离度的丧失。相反，如果谱带展宽最小化，那么就能得到最高效的色谱行为，提高灵敏度和分离效率。
没错，上面这张图很明显，右边的比左边分离度高太多了，最重要的原因就是：右边的系统具有较小的谱带展宽。
色谱峰的谱带展宽又与哪些因素相关呢？谱带之所以展宽，必然是系统内有允许谱带展宽的空隙，分析物从进入系统开始到出检测器，其间经过的所有空隙体积都会引起展宽。所有空隙体积的总和，就是系统的谱带展宽体积。谱带展宽体积是色谱系统的一个极为重要的参数。
谱带展宽体积包括两部分，一是柱内扩散体积，另一个是柱外扩散体积。柱内扩散体积一般和色谱柱的物理参数、粒径、内径和长度直接相关，小粒径的色谱柱扩散体积小（前文已经说明了：小粒径填料是获得超高效的一个必要条件）。而柱外扩散体积一般包括目标物经过的管路，接口和检测池的体积，可以看出，柱外扩散体积和色谱系统性能息息相关。
结论就是：
获得超高效分离性能的最后一个必要条件是：更低的柱外扩散体积。
只有：小粒径填料+超高压+更低柱外扩散体积，才能获得完美的超高效分离。这三者联合构成了超高效色谱的充分必要条件。
下图对比了某商用系统（系统耐压>20,000 PSI，但厂家未公布柱外扩散体积数据）和Waters ACQUITY I-Class UPLC的区别。可以明显看到，I-Class柱外扩散体积更小，可以更充分地发挥亚2μm粒径填料的效果，获得更优秀的分离效果。
HPLC、UHPLC、UPLC的柱外扩散体积对比
借推出ACQUITY Arc UHPLC之际，Waters重新定义了HPLC、UHPLC和UPLC的界限。下表用以比较三种类别液相色谱的差异。
| HPLC | UHPLC | UPLC | |
| 扩散体积 | >30μL | 15 - 30 µL | < 15 µL |
| 色谱柱 | 3.0-4.6 mm内径3-10 µm颗粒选择 代表：4.6mm内径, 5µm | 2.1-4.6 mm内径1.7-5 µm颗粒选择 代表：3.0 mm内径，2-3.5μm 实心核颗粒色谱柱 | 1.0-4.6 mm内径1.6-5 µm颗粒选择 代表：2.1 mm内径，亚2μm |
| 最高耐压 | <6,000 PSI | ≥9,000 PSI | ≥15,000 PSI |
| 代表系统，显示扩散体积和最高耐压 | Alliance 34 μL，6,000 PSI Prominence 35 μL， 6,000 PSI | ACQUITY Arc 25 µL，9,500 psi Agilent 1260 Infinity 25 µL，9,000 PSI | ACQUITY UPLC 10 μL，15,000 PSI H-Class 7 μL,15,000 PSI I-Class 5 μL,18,000 PSI |
HPLC高效液相色谱：扩散体积>30μL，最高耐压<6,000 PSI的液相色谱系统，最适宜色谱柱粒径是5µm；
UHPLC超高效液相色谱：扩散体积15 -30 µL，最高耐压≥9,000 PSI的液相色谱系统，最适宜色谱柱是粒径粒2-3.5μm的实心核颗粒色谱柱；
UPLC（超效能液相色谱，这中文名字是笔者自己取的，还麻烦大家再取个合适的名字）：扩散体积<15 µL，最高耐压≥15,000 PSI的液相色谱系统，最适宜色谱柱粒径是 <2µm；
至于上述各种类型色谱给用户带来的不同感受，大家可回顾和参考超高效液相色谱的好处：更高分离度、更高效率、更快速度、更省溶剂、更环保、更适合连接质谱等等。
为什么说是重新定义？
本文写到此处，读者可能会问：为什么说Waters重新定义了UPLC和UHPLC的界限呢？
2004年Waters在推出UPLC之时，UPLC作为一个产品名称为ZL所有，之后其他厂家推出的超高效液相色谱系统通称为UHPLC。在很长一段时间里，市场上将超高效液相色谱统称为UHPLC/UPLC，各家也推出了从低到高的各种系统配置。
正如达尔文的进化论所述：物种进化的趋势是分化，那么产品品类最终也要趋于分化， Waters用ACQUITY Arc UHPLC把UPLC和UHPLC拆分为两个品类，并建立了衡量的3大标准：耐压程度、柱外扩散体积、最适宜的色谱柱粒径。
新产品ACQUITY Arc UHPLC
让我们在此回顾一下新产品ACQUITY Arc UHPLC的特征：
ACQUITY Arc UHPLC
ACQUITY Arc系统是一套具有四元溶剂管理器的现代液相系统，用以填补HPLC和UPLC之间的性能差距，适用于在使用现有方法和已经验证过了的试验的同时，寻求功能全面及性能稳定的科学家们。
- 真正的“即插即用”方法兼容性：基于Arc Multi-flow path技术，只需一个切换即可实现在HPLC和UHPLC分离之间的转换
- UHPLC方式下，将2-3 μm颗粒色谱柱的效能最大化，提高方法的色谱性能
- 一键启动的质谱检测：使用ACQUITY QDa检测器
- 提供完整的LC检测器：包括光电二极管阵列、UV/Vis、荧光、示差折光和蒸发光散射检测器。
- 梯度程序中直接输入pH值和离子强度：使用Auto●Blend Plus技术，通过改变溶剂混合比例实现pH最小增量的增加；避免了繁琐的手动配制流动相并减少人为误差。
- 极低的交叉污染（<0.002%）：先进的FTN模式可通过运行中一直冲洗针内壁来最小化交叉污染。
对于喜爱Waters的用户，Waters提供了3类液相。如果只需要HPLC，请选择Alliance这款经典之作；如果需要UHPLC或同时需要HPLC和UHPLC，请选择ACQUITY Arc；如果需要超级的性能，请选择ACQUITY UPLC系列，包括四元的H-Class和二元的I-Class。
最后，笔者提出两个愿望：
1、ACQUITY Arc UHPLC的性能虽好，但希望价格也好，尤其是：针对中国用户的价格要好。
2、Waters可以在UPLCZL到期后转成公共词汇，只有让更多的供应商能够使用UPLC这个名称，UHPLC和UPLC才能真正从拗口的UPLC/UHPLC中分化出两个品类。市场的领导者，一定会建立品类，并允许让更多的竞争者进来，一同把品类做大做强。
400-6699-117 转 6220
