常用缓冲液配制
实验概要
常用缓冲液配制
实验步骤
一.电泳缓冲液
A: 测序凝胶加样缓冲液:
98%去离子甲酰
10mol/L EDTA(pH8.0)
0.025%二甲苯青FF
0.025%溴酚蓝
B: 甲酰胺:许多批号的试剂级甲酰胺,其纯度符合使用要求,无须再进行处理。不过,一旦略呈黄色,则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理,并用Whatman 1号滤纸过滤2次,去离子甲酰胺分装成小份,充氮存于-70℃。
常用的电泳缓冲液
缓冲液 | 使用液 | 浓贮存液(每升) |
Tris-乙酸(TAE) | 1×:0.04mol/L Tris-乙酸 | 50×:242g Tris碱 |
0.001mol/L EDTA | 57.1ml冰乙酸 | |
100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) | ||
Tris-磷酸(TPE) | 1×:0.09mol/L Tris-磷酸 | 10×:10g Tris碱 |
0.002mol/L EDTA | 15.5ml85%磷酸(1.679g/ml) | |
40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) | ||
Tris-硼酸(TBE) | 0.5×0.045mol/L Tris-硼酸 | 5×:54g Tris碱 |
0.001mol/L EDTA | 27.5硼酸 | |
20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) | ||
碱性缓冲液 | 1×:50mmol/L NaOH | 1×:5ml 10mol/L NaOH |
1mmol/L EDTA | 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0) | |
Tris-甘氨酸 | 1×:25mmol/L Tris | 5×:15.1g Tris |
250mmol/L 甘氨酸 | 94g苷氨酸(电泳级)(pH8.3) | |
0.1% SDS | 50ml 10% SDS(电泳级) |
说明:
(1)TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物,为避免这一问题,可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液,出现沉淀后则予以废弃。以上都以1×TBE作为使用液(即1:5稀释浓贮液)进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1:10稀释的贮存液作为使用液。行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小, 故通过缓冲液的电流量通常较大,需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。
(2)碱性电泳缓冲液应现用现配。
(3)Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
C: 2×SDS凝胶加样缓冲液:
100mmol/L Tris·HCl(6.8)
200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)
4%SDS(电泳级)
0.2%溴酚蓝
20%甘油
不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温,应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。
D: 凝胶加样缓冲液
缓冲液类型 | 6×缓冲液 | 贮存温度 |
Ⅰ | 0.25%溴酚蓝 | 4℃ |
0.25%二甲苯青FF | ||
40%(W/V)蔗糖水溶液 | ||
Ⅱ | 0.25溴酚蓝 | 室温 |
0.25%二甲苯青FF | ||
15%聚蔗糖(Ficoll400) | ||
Ⅲ | 0.25%溴酚蓝 | 4℃ |
0.25%二甲苯青FF | ||
30%甘油水溶液 |
使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三:增大样品密度;以确保DNA均匀进入样品孔内;使样品呈现颜色,从而使加样操作更为便利,含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍,而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时,溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同,而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%~1.4%的范围内,这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。
选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是,对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料,因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。
二.各种pH值的Tris缓冲液的配制
各种pH值的Tris缓冲液的配制 | |
所需pH值(25℃) | 0.1mol/L HCl的体积 |
7.1 | 45.7 |
7.2 | 44.7 |
7.3 | 43.4 |
7.4 | 42.0 |
7.5 | 40.3 |
7.6 | 38.5 |
7.7 | 36.6 |
7.8 | 34.5 |
7.9 | 32.0 |
8.0 | 29.2 |
8.1 | 26.2 |
8.2 | 22.9 |
8.3 | 19.9 |
8.4 | 17.2 |
8.5 | 14.7 |
8.6 | 12.4 |
8.7 | 10.3 |
8.8 | 8.5 |
某一特定pH值的0.05mol/L Tris缓冲液的配制:将50ml 0.1mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积(单位:ml)的0.1ml/L HCl混合,加水将体积调至100ml