胶体金标记实验的操作方法与步骤
胶体金标记实验的实验过程主要包含以下步骤：胶体金标记蛋白的制备及其与胶体金之间的用量比例的确定、胶体金和蛋白的结合、胶体金标记蛋白的纯化与质量检测等。
1、蛋白质的处理：胶体金标记蛋白的制备
胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子 量等都影响胶体金与蛋白质的结合。
(1)待标记蛋白溶液的制备 将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。
(2)待标胶体金溶液的准备 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0;标记McAb时，调至8.2;标记亲和层析 抗体时，调至7.6;标记SPA时，调至5.9～6.2;标记ConA时，调至8.0;标记亲和素时，调至9～10.
由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。
由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。
一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。
2、蛋白质最适用量的选择：胶体金与标记蛋白用量之比的确定
(1)根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml.
(2)将标记蛋白(以IgG为例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5µg/ml～50µg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。
(3)5min后，在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。
(4)结果观察，对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象;而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10%～20%。
将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质5～40ug)加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1ml 10%NaCl溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10%即为最佳标记蛋白量。
3、标记：胶体金与蛋白质(IgG)的结合
将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5%胎牛血清(BSA )和1%聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量：5%BSA使溶液终浓度为1%;1%聚乙二醇加至总溶液的1/10.
在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子 在金颗粒表面的吸附量最大。
下述标记步骤最为常见：
①用0、1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH(标记SPA时调到pH6.0)。
②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液(体积为2～3ml)，搅拌2～3分钟。
③加入5ml1%PEG20000溶液。
④于10000～100000g离心30～60分钟(根据粒径大小选择不同离心条件)，小心吸去上清液(切忌倾倒)。
⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以 A1cm/540nm=1.5左右为宜，以 0.5mg/ml叠氮钠防腐，置4℃保存。
⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含 0.1%BSA 的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2，以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0.
4、胶体金标记蛋白的纯化
(1)超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。
用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心(20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min)20min，弃去凝聚的沉淀。
然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4℃离心1h;20nm～40nm胶体金结合物，14 000g，4℃离心1h.仔细吸出上清，沉淀物用含1%BSA的PB液(含0.02%NaN3)，将沉淀重悬为原体积的1/10，4℃保存。如在结合物内加50%甘油可贮存于-18℃保存一年以上。
为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10%～30%蔗糖或甘油进行密度梯度离心，分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。
(2)凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1/5～1/10.再经1 500r/min离心20min.取上清加至Sephacryl S-400(丙烯葡聚糖凝胶S-400)层析柱分别纯化。
层析柱为0.8 cm×20cm，加样量为床体积的1/10，以0.02Mol/L PBS液洗脱(内含0.1%BSA，0.05%NaN3，pH8.2者用IgG标记物)，流速为8ml/h.按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。
继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装，4℃保存。最终可得到70%～80%的产量。
5、胶体金蛋白结合物的质量鉴定
(1)胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网(铜网也可)蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。
(2)胶体金溶液的OD520nm值测定：胶体金颗粒在波长510nm～550nm之间出现最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液(含1%BSA，0.02%NaN3)将胶体金蛋白试剂作1︰20稀释，OD520=0.25左右。一般应用液的OD520应为0.2～0.4。
(3)金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法(MF-IGSSA)。将可溶性抗原(或抗体)吸附于载体上(滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜)，用胶体金标记的抗体(或抗原)以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。
本文详述了胶体金标记蛋白的操作步骤，在以上标记的操作步骤中需要注意，所有溶液中均不可含杂质微粒，可选用高速离心或微孔滤膜进行预处理。
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编辑： dxy_vkgu6tp0
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