哮喘致敏小鼠模型的建立及脾脏CD4+T细胞的分离（一）

哮喘致敏小鼠模型的建立及脾脏 CD4+T细胞的分离

Establishment of sensitized asthma model in mice and CD4+T lymphocyte isolation from spleens

程晓明,王长征,李淑平,钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所,重庆 400037)

提 　要 : 目的 　建立一种可靠的哮喘致敏小鼠模型及分离脾脏 CD4+T细胞。方法 　采用卵蛋白致敏的方法建立模型 ,运用panning法分离 CD4+T细胞。结果 　此模型小鼠肺组织呈现典型的哮喘样病理改变 ,其外周血、支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞百分比(EOS%)显著高于正常对照组( P < 0.01) 。CD4+T细胞纯度经流式细胞术(FCM)检测 ,纯度达 97.3 %。结论 　此方法建立的模型及分离的 CD4+T细胞可用于哮喘的实验研究。

建立哮喘动物模型及分离高纯度的 CD4+T细胞是实验研究哮喘发病机制的重要前提。本实验就小鼠致敏模型的建立及其脾脏 CD4+T细胞的分离方法进行介绍。

1 　材料与方法

1.1 　主要试剂及材料

1.1.1 　淋巴细胞分离液 　　将 9 % ficoll 400 溶液(Sigma 公司)和 33.9 %泛影葡胺溶液按比例混合 ,调比重至 1.090。

1.1.2 　尼龙毛柱的制备 　　称取 80mg 尼龙毛 ,将其细致撕匀后装入 2 ml 一次性注射器内 ,柱高约 4 cm。用 Hanks 液充分浸湿尼龙毛柱 ,使其内不留气泡 ,高压灭菌消毒。使用前用预温至 37 ℃的 RPMI 1640(含 10 %胎牛血清 ,Fetal calf serum ,FCS)洗柱后封闭下端出口。

1.1.3 　CD8+单克隆抗体(Monoclonal antibody ,mAb)包被平皿的制备 　　取若干个聚苯乙烯平皿 ,将 CD8+mAb 溶液(北京邦定公司)100μl 加入平皿中 ,并加入 0. 05 mol/L 碳酸盐缓冲液(pH9.5)3 ml ,混匀 ,室温下无菌放置 40 min ,磷酸盐缓冲液 (PBS,pH7.2)漂洗 ,加入含 1 % FCS的 PBS,室温下无菌孵育 15 min ,PBS漂洗 ,4 ℃保存备用。

1.2 　实验动物及分组

　　4～6 周健康 BALB/ c 小鼠 40 只 ,雌雄不限 ,体重 16～20 g ,由第三军医大学实验动物中心提供。将小鼠随机分为两组 ,A组为正常对照组 ,以生理盐水代替鸡卵清蛋白 (Ovalbumin ,OVA , Grade Ⅱ, Sigma 公司) 致敏和激发小鼠 ;B 组为致敏模型组 ,给予 OVA致敏和激发。

1.3 　致敏小鼠模型的建立

分别于第 1 天、第 13 天经小鼠腹腔注射 OVA 10μg 和氢氧化铝凝胶(Al(OH)3)20 mg混合液;第 25 天时 ,将每只小鼠单独置于 5 L 密闭容器中 ,以 1 % OVA 进行雾化吸入激发 ,使小鼠暴露在 OVA 气雾中 20～30 min 直至出现哮喘样发作为止 ,持续 6 d。由 402 型超声雾化器(上海合力医用器械厂)提供雾化动力。

1.4 　外周血、支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage

fluid ,BALF)中嗜酸性粒细胞百分比 (percentages

of eosinophils ,EOS %)计数及肺组织标本留取

1.4.1 　外周血及 BALF中 EOS%计数 　　各组小鼠各 14 只最

后一次激发 24 h 后 ,经腹腔麻醉 ,行气管切开 ,收集 BALF 5ml ,

针刺心脏取血约 0. 5～0. 8 ml。将全部液体离心 ,收集沉淀细

胞 ,加入红细胞裂解液去除红细胞。用 EOS 计数液行 EOS 计数。